抗体酶及其应用,抗体酶及其应用前景

('抗体酶是具有催化性质的抗体，它同时具备抗体和酶的特征，可催化多种化学反应，如酰基转移、酯水解、酰胺水解、重排反应、光诱导反应、氧化还原分应、金属螯合反应等。用人工方法合成的抗体酶，可作为研究酶作用机理的有力工具，用于催化大量天然酶不能催化的立体专一性反应，更为开发具有高度选择性的药物指明了方向。本文对抗体酶的研究开发思路和历史、催化反应类型、制备方法及发展前景作了综述。关键词抗体酶过渡态类似物催化反应抗体酶是具有催化性质的抗体。1986年，Lerner和Schultz[1]同时在美国《Science》周刊上发表了他们各自独立领导的研究组对抗体酶的研究报告，并将之命名为Abzyme。Abzyme本质为免疫球蛋白（Ig），只是在易变区被赋予了酶的属性，故又被称为催化抗体（Catalyticantibody）。抗体有极高的亲和力，解离常数在10~10mol/L，这与酶相似，但无催化活力。酶的催化机制在于它能结合底物产生过渡态，降低能垒，改变化学反应的速度。抗体酶同时具备了抗体和酶的特征，应用前景十分广阔。一、抗体酶设计的研究思路及历史过程1946年，Pauling用过渡态理论阐明了酶催化的实质，即酶之所以具有催化活力是因为它能特异性结合并稳定化学反应的过渡态(底物激态)，从而降低反应能级。他指出，酶通过某种方式与高能、短寿命的过渡态结合而起催化作用。这个过渡态构型中某些键在形成，另一些键在断裂，存在时间极短，半衰期约为10~10s，实际中极难捕获。同时，Pauling又指出酶和抗体的根本不同在于前者选择性的结合一个化学反应的过渡态，而抗体则是结合一个基态分子。既然过渡态分子难以捕获，而过渡态类似物是能够模拟一个酶催化反应过渡态的结构的稳定物质，于是人们就设想，只要寻找到与反应中决定性步骤的相应酶紧密结合的酶竞争性抑制剂，就等于发现了过渡态类似物；还有一种思路，就是这种类似物也能根据化学反应机制推测设计出来。然后，以过渡态类似物为半抗原，利用哺乳动物的免疫系统，诱导与其互补构象的抗体产生，这种抗体即具有催化活性——这就是1969年Jencks提出的，他发展了Pauling的理论；接着，Kohler和Milstein于1975年发明了具有历史意义的单克隆技术，使抗体酶的生产成为可能。1984年Lerner进一步推测：以过渡态类似物作为半抗原，则其诱发出的抗体即与该类似物有着互补的构象，这种抗体与底物结合后，即可诱导底物进入过渡态构象，从而引起催化作用。根据这个猜想Lerner和P．C．Schultz分别领导各自的研究小组独立地证明了：针对羧酸酯水解的过渡态类似物产生的抗体，能催化相应的羧酸酯和碳酸酯的水解反应。1986年美国《Science》杂志同时发表了他们的发现，并将这类具有催化能力的免疫球蛋白称为抗体酶或催化抗体。二、抗体酶催化的反应抗体酶可催化多种化学反应，包括酰基转移、酯水解、酰胺水解、重排反应、光诱导反应、氧化还原分应、金属螯合反应等。[2]1、酰基转移反应生物体内蛋白质合成是一个复杂的过程。氨基酸在掺入肽链之前必须进行活化以获得额外的能量，这一活化过程即是酰基转移反应。1986年，Tramonatano等研制成功首例酰基转移酶抗体。目前，该抗体酶的研制已接近实用阶段。Jacolson等设计了一个中性磷酸二酯作为反应过渡态的稳定类似物，得到的单克隆抗体可以催化带丙氨酰酯的胸腺嘧啶3’-OH基团的氨酰化反应，反应速度为5.4×10(mol/L）⋅min，比无催化反应的速度提高了10倍。这使新型tRNA的合成工作获得突破性进展。2、水解反应目前，抗体酶能够催化生物体内两类水解反应：酯水解和酰胺水解。2.1、磷酸酯水解反应磷酸酯键是自然界最稳定的键之一，它的水解是对抗体酶的挑战。Janda等利用稳定的五配位氧代铼络合物A模拟RNA水解时形成的环形氧代正膦中间物，产生了一种单抗G12，可以催化水解磷酸二酯键。它的催化速度常数（Kcat）=1.53×10s,米氏常数(Km)=240μmol/L。2.2、酰胺水解反应蛋白质的水解均属于酰胺水解。B.L.Iverson等用Co—Ⅲ三乙烯酰胺—肽复合物作为半抗原，得到能特异性的切割Gly-Phe之间肽键的抗体酶。这意味着，随心所欲的切割肽段成为可能，蛋白质一级结构的测定将会变得十分简单。3、重排反应Claisen重排是有机化合物异构化的一种重要形式，生物体内一些化合物在光照下会发生Claisen重排。Jackson等研制的分支酸异构化抗体酶表现出高度的立体专一性，只能催化以（-）—分支酸为底物的反应，而对（+）—分支酸无作用,其活化熵接近于零。这一研究表明抗体可以诱导底物的构象，呈现有利于重排的状态。Katherine等发现抗体酶1F7具有分支酸异构化催化活性，于是将该抗体的编码基因克隆，在缺乏分支酸异构酶的Saccharromycescerevisiae菌株中扩增表达，产生催化效率60%~70%的抗体酶。这一表达系统的成功研制使得运用基因工程手段对第一代抗体酶进行改造成为可能。4、光诱导反应光诱导反应包括光聚合反应和光裂解反应。这两类反应在植物体内显得尤为重要。DNA的修复也涉及到光诱导反应，Cochran对胸腺嘧啶二聚体光解进行研究，发现天然光复活酶的活性中心是色氨酸，由此找到相应的抗体酶IgG15F1—3B1，此抗体的转换数（T.N.）和光复活酶相近。Balan研究了光聚合反应的抗体酶，通过诱导法，得到的抗体酶催化效率虽不高，但也使反应速度提高了2.5倍。5、氧化还原反应氧化还原反应在生物体内十分广泛，主要是呼吸链的一系列反应。在溶液中，氧化态黄素与还原态黄素的电位差是206mV。Shokat认为可以根据氧化态和还原态在形状上的不同（氧化态为平面状，还原态为曲面状）构制能与氧化态结合的抗体，通过特异性结合，使氧化态稳定，从而使标准还原电位差扩大。据此设想，Shokat制得了对氧化态Km=8mmol/L，对还原态Km=300nmol/L的抗体，使标准电位差变为-342mV，由此，黄素还原态的还原范围相应扩大，一些原来无法按其还原的物质（即标准还原电位差大于抗体酶催化的黄素标准还原电位差）得以还原。这意味着抗体酶可以使热力学上原来无法进行的氧还反应得以进行。6、金属螯合反应金属螯合反应对于辅酶、辅因子和酶的结合来说意义重大。P.G.Schultz等用N-甲基卟啉诱导产生的抗体可以催化平面状卟啉的金属螯合反应，例如，它不仅可以催化Zn和卟啉的螯合，还可以催化Co、Mn和卟啉的螯合。如果以原卟啉Ⅸ或次卟啉Ⅸ作为底物则不表现催化活性，说明该抗体酶对其中某些金属卟啉具有很高的亲和力。由此，人们可以研制抗体—血红素复合物为催化剂催化氧化还原反应和电子传递反应。7、磺酸酯闭环反应Lerner等人用脒基离子化合物作为半抗原产生的抗体酶（17G8）可以催化磺酸酯化合物的闭环反应三、抗体酶的制备方法制备抗体酶的方法有拷贝法、引入法、诱导法、化学修饰法和基因工程法等，这里重点介绍前三种。1、拷贝法拷贝法主要根据抗体生成过程中抗原-抗体互补性来设计的。该法操作步骤简单，对于来源紧张的酶来说可用生产单克隆抗体的方法来大量生产，不足之处是这类抗体酶需要筛选，具有一定的盲目性。过程如下：免疫动物免疫动物并单克隆化抗酶抗体已知酶（抗原）2、引入法此法借助基因工程和蛋白质工程方法将催化基因引入到已有底物结合能力的抗体的抗原结合位点上。具体来说，可以采用寡核苷酸定点诱变技术将特定的氨基酸残基引入抗原结合部位使其获得催化功能，也可以采用选择性化学修饰的方法将人工合成的或天然存在的催化基因引入到抗原结合部位。例如：P.G.Schultz等人使用可裂解亲和标记物将巯基的柄状亲和基团引入到抗2,4—二硝基苯酚（DNP）的单抗MOPC315的抗原结合位点，得到的抗体酶对含有DNP与香豆素的羧酸酯的水解反应催化效率高二硫苏糖醇6×10倍。具有原酶活性的抗体（抗体酶）筛选单克隆的抗抗体3、诱导法本法即用设计好的半抗原，通过间隔链与载体蛋白（如牛血清白蛋白等）偶联制成抗原，然后采用标准的单克隆技术制备、分离、筛选抗体酶。其中的半抗原也就是过渡态类似物。它是根据推测设计的，毕竟一般反应的过渡也只是理论推测，未在结构上予以阐明。过程如下：载体蛋白过渡态类似物（半抗原）偶联体（抗原）免疫动物并单克隆抗体酶四、抗体酶的发展前景[3]1、抗体酶的利用价值从抗体酶的实践看出，抗体酶是研究酶作用机理的有力工具。酶抑制剂的研究支持了Pauling过渡态理论，但它只能提供作用过程中结合专一性的信息，不能给出结合后发生催化反应以及结合与催化之间的关系。抗体酶实验则弥补了这一缺陷。除了基础理论研究的价值，抗体酶的应用前景也令人鼓舞。Lerner指出，若将催化水解反应的抗体酶研究深入下去，极有可能得到一种新型蛋白酶，这种抗体酶在医学上可用来专一破坏病毒蛋白质及清除体内“垃圾”。Lerner还提到，将具有立体专一性的抗体酶应用于制药工业，将有助于解决对映体拆分的难题。随着制备抗体酶新方法的不断发展，抗体酶的催化反应的范围将进一步拓宽特别是对那些天然酶不能催化的反应，则可研制抗体酶来进行催化。其次，抗体酶的研究，为人们提供了一条合理途径去设计适合于市场需要的蛋白质，即人为地设计制作酶。这是酶工程的一个全新领域。例如：利用动物免疫系统产生抗体的高度专一性，可以得到一系列高度专一性的抗体酶，成为针对性强、药效高的药物，于是生产高纯度立体专一性的药物成为现实。又如：以某个生化反应的过渡态类似物来诱导免疫反应产生特定抗体酶，以治疗某种酶先天性缺陷的遗传病。抗体酶还可有选择地使病毒外壳蛋白的肽键裂解，从而防止病毒与靶细胞结合。另外，抗体酶的固定化已获得成功，将大大地推进工业化进程。2、存在的问题尽管抗体酶研究取得了很大进展，离开实际应用仍有一段距离。首先是催化效率问题：目前所得的大部分催化抗体的反应速度加强只能是中等水平的，比酶催化低2—3个数量级；因此，如何提高抗体酶的催化效率是个挑战。其次是筛选问题：目前的筛选方法只能筛选库中有用抗体的一小部分；一般是通过对半抗原结合力的大小来筛选的，而不是通过催化活性来筛选，可是对半抗原亲和力最大的不一定是最好的催化抗体——相信正在开发的catELISA法能够解决这一问题。还有抗体酶专一性、底物抑制、催化基团最适装配等问题都亟待人们去攻克。抗体酶是抗体与酶结合的产物，它的发展有赖于抗体与酶的结构的深入研究，特别是对酶作用机制的深入研究——这一方面还有待人们努力抗体酶应用简介时间：2011-02-2411:03:27来源：作者：点击：54次1946年,鲍林(Pauling)用过渡态理论阐明了酶催化的实质,即酶之所以具有催化活力是因为它能特异性结合并稳定化学反应的过渡态(底物激态),从而降低反应能级.1969年杰奈克斯(Jencks)在过渡态理论的基础上猜想：若抗体能结合反应的过渡态,理论上它则能够获得催化性质.1984年列那(Lerner)进一步推测：以过渡态类似物作为半抗原,则其诱发出的抗体即与该类似物有着互补的构象,这种抗体与底物结合后,即可诱导底物进入过渡态构象,从而引起催化作用.根据这个猜想列那和苏尔滋(P．C．Schultz)分别领导各自的研究小组独立地证明了：针对羧酸酯水解的过渡态类似物产生的抗体,能催化相应的羧酸酯和碳酸酯的水解反应.1986年美国Science杂志同时发表了他们的发现,并将这类具催化能力的免疫球蛋白称为抗体酶或催化抗体.抗体酶具有典型的酶反应特性；与配体(底物)结合的专一性,包括立体专一性,抗体酶催化反应的专一性可以达到甚至超过夭然酶的专一性；具有高效催化性,一般抗体酶催化反应速度比非催化反应快104～108倍,有的反应速度已接近于天然酶促反应速度；抗体酶还具有与天然酶相近的米氏方程动力学及pH依赖性等.将抗体转变为酶主要通过诱导法、引入法、拷贝法三种途径.诱导法是利用反应过渡态类似物为半抗原制作单克隆抗体,筛选出具高催化活性的单抗即抗体酶；引入法则借助基因工程和蛋白质工程将催化基因引入到特异抗体的抗原结合位点上,使其获得催化功能,拷贝法主要根据抗体生成过程中抗原-抗体互补性来设计的.博莱克(Pollack)等以硝基苯酚磷酸胆碱酯作为半抗原诱导产生单抗,经筛选找到加快水解反应1.2万倍的抗体酶.抗体酶可催化多种化学反应,包括酯水解、酰胺水解、酰基转移、光诱导反应、氧化还原分应、金属螯合反应等.其中有的反应过去根本不存在一种生物催化剂能催化它们进行,甚至可以使热力学上无法进行的反应得以进行.抗体酶的研究,为人们提供了一条合理途径去设计适合于市场需要的蛋白质,即人为地设计制作酶.它是酶工程的一个全新领域.利用动物免疫系统产生抗体的高度专一性,可以得到一系列高度专一性的抗体酶,使抗体酶不断丰富.随之出现大量针对性强、药效高的药物.立本专一性抗体酶的研究,使生产高纯度立体专一性的药物成为现实.以某个生化反应的过渡态类似物来诱导免疫反应,产生特定抗体酶,以治疗某种酶先天性缺陷的遗传病.抗体酶可有选择地使病毒外壳蛋白的肽键裂解,从而防止病毒与靶细胞结合.抗体酶的固定化已获得成功,将大大地推进工业化进程',)