血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳实验报告

('血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳实验报告实验原理1.电泳的基本原理带电颗粒在电场中向着与其电性相反方向移动的现象称为电泳。电泳时不同的带电粒子在同一电场中泳动速度不同。带电颗粒(球形分子)在电场中的电泳速度(V)从上式看出，带电颗粒在电场中的移动速度(V)与颗粒带电荷量(Q)以及电场强度(E)成正比，与球形分子的大小(半径为r)及所在介质的粘度(η)成反比。因此,在同一电场、同一介质中进行电泳时，带不同电荷，不同大小的颗粒就可以通过电泳而被分离。在实际操作中，为了不考虑不同电压对电泳速度的影响，我们常用迁移率（moverate,M）来表示带电颗粒的电泳特性，迁移率指带电颗粒在单位电场强度下的电泳速度，即可见，带电颗粒的净电荷越多，分子颗粒越小，在电场中的迁移率就越快；反之越慢。但电泳速度和电泳迁移率是两个不同的概念，后者有利于不同电场强度下电泳结果的比较，各种带电颗粒在一定条件下测得的迁移率是一个常数。2.影响电泳的主要因素(1)电泳介质pH值的影响:对于蛋白质和氨基酸等两性分子，电泳介质的pH值影响蛋白质的电离情况，即可决定蛋白质的带电量(Q)。pH值小于等电点，分子带正电荷，向负极泳动，如果pH大于等电点，分子带负电荷，向正极泳动。pH值偏离等电点越远，分子所带净电荷越多，其泳动速度越快。当缓冲液pH等于其等电点时，分子处于等电状态，不移动。由于血清蛋白质的等电点多在pH4～6之间，因此，分离血清蛋白常用pH8.6的巴比妥缓冲液或三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液。(2)缓冲液的离子强度:离子强度低，电泳速度快，分离区带不易清晰；离子强度高，电泳速度慢，但区带分离清晰。如离子强度过低，缓冲液的缓冲量小，不易维持pH的恒定；离子强度过高，则降低蛋白质的带电量(压缩双电层)使电泳速度减慢。所以常用离子强度为0.02～0.2之间。(3)电场强度的影响:电场强度和电泳速度成正比关系。电场强度以每厘米的电势差计算，也称电势梯度。如纸电泳的滤纸长15cm，两端电压(电势差)为150V，则电场强度为150／15=10V／cm，电场强度愈高，则带电粒子的移动愈快。随着电场强度的增高，电流强度增加，产热也增多。产热的不良后果是：①引起水的蒸发，改变溶液pH及离子强度；②引起介质温度高，可使蛋白质变性。因此电泳必须控制电压在一定范围之内，当进行高压电泳时，必须装备有效的冷却装置。(4)电渗:在电场中，由于多孔支持物吸附水中的离子使支持物表面相对带电，在电场作用下，溶液就向一定方向移动，此种现象称为电渗。如纸上电泳所用的滤纸纤维素带有负电荷；琼脂糖电泳中，所用的琼脂糖由于大量硫酸根的存在也带有负电荷，它们使水感应产生水合氢离子(H+3O)。在外电场的作用下，水向负极移动。如果被测定样品也带正电荷，则移动更快；如果被测定样品带负电荷，则移动减慢。所以电泳时，颗粒泳动所表现的速度决定于颗粒本身的泳动速度和溶液的电渗作用。因此在选用支持物时，应尽量避免高电渗作用的物质。3.醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳是利用醋酸纤维素薄膜做固体支持物的电泳技术。醋酸纤维薄膜具有匀一的泡沫状结构（厚约120μm），渗透性强，对分子移动无阻力，用它做区带电泳的支持物，用样量少，分离清晰，无吸附作用，应用范围广和快速简便,且染色后的薄膜可用乙醇和冰醋酸溶液浸泡透明，透明后的薄膜便于保存和定量分析。本实验以醋酸纤维素薄膜作为支持物，于薄膜一端加微量血清，膜两端连接于缓冲液。血清蛋白质的等电点均低于pH7.0，电泳时常采用pH8.6的缓冲液，因此，各种蛋白质皆带负电荷，在电场中向正极移动，因泳动速度不同而被分离。醋酸纤维素薄膜电泳可把血清蛋白质分离为清蛋白A、α1、α2、β和γ-球蛋白，将蛋白质染色后，可按染色区带位置进行定性观察，也可对各条色带进行定量测定。实验步骤1.点样将醋酸纤维薄膜(2.5cm×8cm)一条，浸于巴比妥缓冲液，待完全浸透后，取出轻轻夹于滤纸中，吸去多余的溶液，再于薄膜的无光泽面的一端2.0cm处，用小玻片蘸取少许血清，垂直印于膜上，待血清渗入薄膜后，以无光泽面向下，两端用数层浸湿的滤纸(或纱布)贴紧，加盖，平衡2～3min，然后通电。2.通电一般电压用110～140V，电流约0.4～0.6mA／cm，时间45～60min。3.染色关闭电源后立即将膜取出，放入染色液中浸染2～3min，然后移入漂洗液中漂洗数次，至蛋白条带清晰，背景无色为止。4.定量取试管6支，编号依次为0（空白）、A、α1、α2、β、γ，将电泳图谱亦按A、α1、α2、β、γ蛋白区带剪开，分别装入相应号码试管中。再在图谱两端无蛋白部位剪一条宽约α1带的空白带放入空白管中。各管中加0.4mol/LNaOH4ml，振摇数次，使染料色泽浸出，30min后，在620nm波长下进行比色，以空白管校正零点，读取清蛋白及α1、α2、β及γ球蛋白各管的吸光度。【计算】吸光度总和T为各种蛋白吸光度的总和：T=A+α1+α2+β+γ。分别按下面算式计算各组分蛋白质的百分数：清蛋白(%)＝(A/T)×100%α1球蛋白(%)＝(α1/T)×100%α2球蛋白(%)＝(α2/T)×100%β球蛋白(%)＝(β/T)×100%γ球蛋白(%)＝(γ/T)×100%现在许多实验室采用光密度计定量法。待薄膜完全干燥后，浸于透明液中约5～10min，取出平贴在玻璃板上，完全干燥后成为透明的膜。然后在光密度计上测定吸光密度，并可绘制成曲线，或者直接计算出各种蛋白质的百分含量。实验反思',)