端粒＼端粒酶研究及应用进展

('端粒＼端粒酶研究及应用进展端粒、端粒酶在维持生命遗传信息稳定、调控细胞生命周期中具有重要作用端粒酶通过维持端粒的长度，使细胞永生化，为抗衰老提供了光明前景，同时也为肿瘤治疗提供了新的希望。研究端粒、端粒酶在肿瘤监测中的作用及研发端粒酶抑制剂作为治疗肿瘤的创新药物已成为近年医学研究的热点。本研究通过查阅相关文献，对端粒、端粒酶研究及应用进展做一综述。标签：端粒；端粒酶；肿瘤；衰老端粒及端粒酶的研究已成为近年医学领域研究的热点。这不仅因为它们具有维持生物遗传信息稳定、调控细胞生命周期的重要功能，还由于端粒及端粒酶的行为异常与多种人类肿瘤及遗传性疾病密切相关。在这些疾病中端粒可表现出缺失、融合及序列缩短等异常，而这些异常又可能受端粒酶的调控。1端粒、端粒酶的发现上世纪初，著名遗传学家McClintockB[1]与MullerHJ[2]发现：染色体的稳定性和完整性是由染色体的末端来维持的。基于此发现，MullerHJ将其命名为“telomere”，此定义来源于希腊词根“末端”（telos）及“部分”（meros）的组合。20世纪60年代，Hayflick研究发现：经过体外培养的正常人成纤细胞的复制过程并非细胞的死亡过程，而只是细胞群中的大部分细胞在经历了数次分裂增殖后停滞在了某个特定状态，仅仅是基因表达方式发生了某些改变，细胞群大部分细胞仍保持其代谢活性，由此，Hayflick在世界上首次提出了细胞衰老的表征：即细胞在一定条件下的“有限复制力”。同时Hayflick还提出了一个大胆的猜测，即细胞内存在某种控制细胞分裂次数的控制器，类似于我们使用的“时钟”。为验证自己的猜想，Hayflick做了大量的细胞核移植实验验证了自己的猜想，并发现这种“钟”位于细胞核染色体的末端，于是将其命名为端粒[3]。20世纪80年代，CWGreider和EHBlackburn2位科学家在四膜虫的提取物中加入1段单链的末端寡聚核苷酸后，发现端粒的长度增加了，这表明的确存在一种可使端粒延长的酶，根据其特点命名为“端粒酶”（telomerase）[4]。2端粒、端粒酶的结构和功能2.1端粒端粒是特异结合蛋白与真核细胞染色体末端的DNA重复序列的复合体。不同物种之间端粒DNA序列存在很大差异，人类端粒长度在5～15kB之间，DNA序列排列方式为TTAGGGn，方向为5’-3’，重复次数约2000次[5]。端粒的主要作用在于防止染色体重组、融合、降解等變化，从而维持染色体的完整、稳定。所有以上功能的实现均主要依赖于端粒的结构完整与长度维持。端粒是线性DNA，由于DNA酶不能复制线性DNA的末端，因此它的末端会伴随周期性的复制过程而逐渐变短。基于以上末端复制特点，端粒会随着细胞分裂逐渐缩短，每分裂1次缩短50～100bp，端粒缩短到其临界长度时，就会导致细胞衰老甚至死亡。因此，正常真核细胞的端粒可被称作“生命之钟”[6]。2.2端粒酶端粒酶属于逆转录酶，端粒的核糖核酸酶就是端粒酶以自身RNA为模板通过逆转录而合成的，端粒酶通过在染色体末端添加端粒序列，从而使端粒能够固定在某个特定长度[7]。人端粒酶包括3个重要部分，即人端粒酶RNA（humantelomeraseRNA，hTRRNA)、人端粒酶相关蛋白和人端粒酶催化亚单位。端粒酶长度在人类各种细胞中差别很大，Gavory等[8]发现端粒酶3′末端残基至少要求存在3个核苷酸片断，才能保持整个端粒酶的活性。纯化端粒酶全酶可知人类端粒酶复合物的相对分子量约为500～1500，与hTRRNA和hTERT（humantelomerasreversetranscriptase)有关的其他亚单位是端粒酶复合物其中的一部分。端粒酶的活性调控，包括mRNA剪接与成熟，hTERT和hTR基因转录，不同组分之间的定位和移位，转录后修饰，具有活性的端粒酶组合，端粒酶结合到端粒产生延长作用等多个水平进行。伴随端粒酶活性的增加，hTERT-mRNA表达水平也相对应成一定比例增加，并且在癌细胞和正常组织中的表达有很大的不同，据此可认定，调控人类端粒酶活性的主要亚单位是hTERT，只要hTERT表达，其他亚单位就会与其共同构成高活性的端粒酶全酶[9]。绝大多数正常细胞端粒酶呈阴性且端粒较长，但某些细胞的端粒在缩短到临界长度时，其自身的端粒酶被激活，发挥断开的延长作用，使端粒固定在一定长度，不再缩短，因此，这些细胞成为不死细胞，或者叫做永生化细胞。正常细胞由于hTERT转录受到抑制作用而缺乏端粒酶活性，抑制作用的缺失使细胞产生了癌变，不死细胞中hTERT基因也因此调高端粒酶活性或者在转录水平上被重新激活。研究发现，端粒酶存在于各种不同细胞中，包括恶性肿瘤细胞及某些正常人体细胞，如外周血单核细胞，成纤细胞，干细胞等[10]。3端粒、端粒酶与肿瘤研究3.1端粒-端粒酶理论假说细胞分裂之前，需要1段RNA作为引物首先进行染色体DNA链复制，复制方向由5’-3’。RNA引物在DNA复制结束后被降解，随后会由上游冈崎片断DNA加以补充或由其作为引物通过合成而补充。由于复制方向决定了3′末端不能补充，从而使端粒随着细胞每分裂一次而逐渐缩短，缩短至临界长度后，会被某种或某些细胞蛋白细探测到，通过某种未知机制，使细胞退出增殖序列，细胞就会因停止分裂而死亡。如果这种探测或者识别机制遭到一定程度破坏，就会有细胞偶尔脱离衰亡进程而继续分裂，细胞分裂进入一种恶性循环状态，进一步加剧染色体的不稳定性和端粒的缺失。端粒的结合蛋白（telomerebindingprotein，TBP）和相关蛋白（telomere-associatedprotein，TAP）对端粒长度具有反调节作用，可抑制端粒酶活性[11]。极少数变种细胞重新激活端粒酶，借助其作用稳定染色体末端结构，使其跳过衰亡临界状态，从而成为不死细胞。不死细胞很多会包含由于端粒末端联接而导致的染色体畸形。因此，端粒酶活性是细胞不死及恶性肿瘤发生的关键性因素[12]。3.2端粒、端粒酶与肿瘤肿瘤早期，端粒大幅度地缩短，而端粒的缩短又反过来影响肿瘤的发生。在人的肿瘤细胞中，通过变异的端粒酶RNA模板表达，激活端粒酶活性。相关研究表明，端粒酶的激活可能是体细胞向肿瘤转变的关键步骤，是细胞癌变的早期事件。80％以上的恶性肿瘤和大多数永生化细胞中端粒酶异常激活，且在这些细胞中存在稳定的端粒。这样的研究结果在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等肿瘤中得到证实。并且，研究人员发现，15％以上的癌前病变也可以检测到端粒酶活性[13]。在肿瘤细胞中，端粒长度的保持除了依靠端粒酶外，还有5％～20％的肿瘤依靠交变延长调聚物（alternatingextendtelomers，ALT）来保持端粒长度。ALT的作用已在多种类型的肿瘤中得到证明，如骨肉瘤等，而最显著的是在成人脑肿瘤中。ALT是依靠DNA复制重组来延长端粒长度的。端粒酶保持端粒长度的机制是重组，而ALT依靠的是扩增TTAGGG重复序列。端粒酶作为恶性肿瘤标记物的观点已经被人们普遍接受，通过hTERT启动因子缺失分析，发现1个核心启动区位于转录启动位点上游大约200bp的位置，这完全可以作为其在肿瘤细胞中特殊表达的参照。Renaud等[14]检测25例宫颈癌和14例正常宫颈组织的端粒酶活性及各亚单位表达水平，发现只有hTERT在宫颈癌细胞和80％以上宫颈癌组织中有较高表达，在正常宫颈组织中为阴性。陈陵等[15]运用脂质体法用克隆了人cDNAhTER的真核荧光颗粒对端粒酶阴性人骨肉瘤细胞染色，发现hTERT与端粒酶活性关系密切，是特征明确的潜在肿瘤标志物，这无疑又为肿瘤的诊断提供了1个新手段。有些疾病以前诊断比较困难，现在也可以并已经通过利用端粒酶得以解决。有学者试图通过免疫组化的方法观察端粒酶在甲状腺滤泡性腺瘤和甲状腺滤泡性癌中的表达，以此来作为两种疾病鉴别诊断的辅助手段[16]。正常人体细胞依靠端粒程序性的缩短限制了转化细胞的增殖，维持细胞固有的分裂次数，引导细胞由增殖序列转向衰亡，据此猜测，正常人体有可能是据此来抑制肿瘤的形成。肿瘤细胞通过激活端粒酶使细胞不死，从而维持肿瘤的无序性增殖生长[17]。作为最为广谱的肿瘤分子标记，端粒酶成为靶向治疗的目标也就是很正常的事情了，已有科学家证明siRNA（shortinterferingRNA）能够有效抑制肿瘤细胞中的端粒酶活性[18]，端粒稳定和端粒酶激活是肿瘤细胞逐渐演变的必需条件，端粒和端粒酶在肿瘤干细胞中的生物表达是治疗肿瘤的理想标靶，针对于此可实现肿瘤的提早明确诊断和及时合理诊治[19]。4端粒、端粒酶与衰老截止目前，相关研究者均认为端粒缩短的关键因素是人类细胞内端粒酶活性的缺失，使得端粒最终不能被细胞识别，使细胞逐渐老化[20]。端粒能够完成染色体末端的复制，防止染色体降解、重组和融合。如果端粒达到最短极限长度染色体双链就极有可能发生断裂，并随之激活细胞的自身监察系统，通过相关机制调控，使细胞进入M1衰亡期。端粒加剧缺失，染色体机制错误加剧恶化，形成恶性循环状态，细胞进入M2衰亡期。当数以千计的碱基端粒DNA缺失后，细胞将不再分裂增殖而转向衰老。人类端粒酶基因定位在5p15.33，其编码了1132个氨基酸的多肽，是核糖蛋白和一种逆转录酶，能以自身RNA为模板合成端粒DNA稳定端粒的长度。据此有人认为端粒缩短是细胞衰老的标志[21-22]。Bodnar等[23]通过研究证实了端粒、端粒酶与衰老关键相关性的最有力的证据。细胞只有通过某种机制阻止端粒的逐步缺失并激活端粒酶活性，才能维持自身正常分裂增殖，保持自身的继续生存，避免走向细胞衰亡。张宗玉教授等相关研究发现，人肺二倍体成纤维细胞端区长度出现非常显著的缺失。同时还测定了人体外周血白细胞端区长度随增龄变化逐渐减少，约35碱基对/年。当染色体端粒缩短到极限最短长度，细胞分裂增殖停止，细胞走向衰亡，最终导致整个生命的死亡[24]。2009年，ElizabethH.Blackburn、CarolW.Greider和JackW.Szostak3位科学家因其“染色体是如何被端粒（telomere）和端粒酶（telomerase）保护的”研究而获2009年度诺贝尔生理学或医学奖，他们的研究揭示了染色体在细胞分裂过程中的完全自我复制，并自我保护不被降解机制，从而掀开了人类衰老与肿瘤等难题的神秘面纱[25]。端粒、端粒酶的发现及相关研究的深入，将人类对衰老、肿瘤的认识带入了一个崭新的时代[26]。随着现代科学的飞速发展，人们对端粒及端粒酶的研究方法与研究范围将更加的深入，对其相关机制及功能作用的发挥也将越加清晰透彻。笔者坚信，随着社会与科技的发展，端粒及端粒酶必将在防治衰老、延长寿命以及肿瘤诊治与彻底根除等方面做出巨大的贡献。[参考文献][1]McClintockB.ThestabilityofbrokenendofchromosomeinZeamays[J].Genetics，1941，26：234-282.[2]MullerHJ.TheRemakingofchromosomes[J].Thecollectingnet-WoodsHole，1938，13：181-198.[3]彥琴，齐元富.端粒酶与肿瘤[J].深圳中西医结合杂志，2011，21（4）：248-251.[4]廖新化.端粒酶和端粒酶的发现历程[J].生命的化学，2009，29（6）：775-780.[5]孔亚红，王朔桂，梁德雄，等.端粒、端粒酶的研究进展[J].中外健康文摘2006，3（5）：10-11.[6]张嵩，王玉虎.端粒、端粒酶及其与肿瘤关系的研究进展[J].中国综合临床2007，23（3）：285-286.（下转第页）（上接第页）[7]曹瑞珍，薛艳，张丽伟.端粒、端粒酶和肿瘤、细胞衰老[J].内蒙古民族大学学报，2006，2（21）：188-191.[8]GaveryG，FarrowM，BalasubramanianS.Minimumlengthrequirementofthealignmentdomainofh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