抗体酶简介及医学上的应用

('抗体酶简介及医学上的应用抗体酶简介及医学上的应用谢祚宜2013级学号1131702027摘要：抗体酶又称催化性抗体，是具有催化活性的免疫球蛋白，在其可变区赋予了酶的属性，是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物，它可促进许多用普通化学方法很难完成，或者天然酶尚未能催化的新奇化学转变，对生物学、化学和医学等多种学科有重要的理论意义和实用价值。在医学、工业、农业等众多领域具有广泛的应用前景和潜在的应用价值。该文综合介绍了抗体酶研究的历史过程、催化抗体的结构、性质、催化的反应类型、抗体酶的制备以及在医学领域的应用及研究进展。关键词:抗体酶;应用1．抗体酶的发现与定义抗体与酶(指P酶)本质上都是蛋白质,都能与相应的抗原或底物特异性结合,差别在于酶是能与反应过渡态选择结合的催化物质,抗体是和基态紧密结合的物质。抗体酶(abzyme)又称催化抗体(catalyticantibody),是一类集抗体高度特异性与酶高效催化活性于一身的蛋白质分子。1986年，Schultz和Lerner同时在美国《Science》周刊上发表了他们各自独立领导的研究组对抗体酶的研究报告，并将之命名为Abzyme。Abzyme本质为免疫球蛋白(Ig)，只是在易变区被赋予了酶的属性，故又被称为催化抗体(Catalyticantibody)。抗体有极高的亲和力，解离常数在10-4～10-14mol/L，这与酶相似，但无催化活力。酶的催化机制在于它能结合底物产生过渡态，降低能垒，改变化学反应的速度。抗体酶显示出在许多领域的潜在应用价值，包括许多困难和能量不利的有机合成反应，前药设计，临床治疗，材料科学等多个方面。抗体酶的结构与抗体分子相似,不同之处在于其可变区除了具有抗原特异的结合能力外,还被赋予了酶的催化活性,因此本质上抗体酶是一类具有催化活性的免疫球蛋白。早期的抗体酶结构类似于免疫球蛋白,含有两条轻链和两条重链,每条链都含有不变区和可变区。随着抗体酶技术的发展,仅含有可变区的单链抗体酶已被制备,它由重链可变区和轻链可变区一起构成,不仅保持了较高的亲和力,而且具有免疫原性低、渗透能力强的特点,更适合作为药物,目前已逐渐取代了传统的双链抗体酶。抗体酶可催化多种化学反应,包括酯水解、酰胺水解、酰基转移、光诱导反应、氧化还原反应、金属螯合反应等,其中有的反应过去根本不存在一种生物催化剂能催化它们进行,甚至可以使热力学上无法进行的反应得以进行。抗体酶的发现,不仅为酶的过渡态理论提供了有力的实验证据,而且为人工制造酶开拓了新途径。我们可以断言:抗体酶的发现是酶学领域的一个跨越,它的研究成功将会引起21世纪生物技术的一场革命。2．抗体酶的发展历史抗体酶(abzyme)，又称催化抗体(catalyticantibody)，是指通过一系列化学与生物技术方法制备出的具有催化活性的抗体，它既具有相应的免疫活性，又能像酶那样催化某种化学反应。1946年，鲍林(Pauling)用过渡态理论阐明了酶催化的实质，即酶之所以具有催化活力是因为它能特异性结合并稳定化学反应的过渡态(底物激态)，形成酶一底物复合物，大大降低了反应的活化能，从而加速了反应速率。他指出，酶通过某种方式与高能、短寿命的过渡态结合而起催化作用。这个过渡态构型中某些键在形成，另一些键在断裂，存在时间极短，半衰期约为10-10～10-12s，实际中极难捕获。同时，Pauling又指出酶和抗体的根本不同在于前者选择性的结合一个化学反应的过渡态，而抗体则是结合一个基态分子。既然过渡态分子难以捕获，而过渡态类似物是能够模拟一个酶催化反应过渡态的结构的稳定物质，于是人们就设想，只要寻找到与反应中决定性步骤的相应酶紧密结合的酶竞上海交通大学1抗体酶简介及医学上的应用争性抑制剂，就等于发现了过渡态类似物;还有一种思路，就是这种类似物也能根据化学反应机制推测设计出来。1969年，Jencks提供免疫诱导产生抗底物基态的抗体，该抗体具有类似酶的催化活性，这个抗体酶设想的提出，使得任何一个化学反应构造一个专一性催化酶成为可能。然而在抗体酶的研制中遇到了两个问题:1、底物基态瞬间存在，无法提取。根据Pauling的酶的竞争抑制实质，可以构造过渡态的稳定类似物作为实际抗原。2、抗原在分子量上有一定的要求，所以一般将类似物作为半抗原接到适当载体上构成抗原。接着，Kohler和Milstein于1975年发明了具有历史意义的单克隆技术，使抗体酶的生产成为可能。1984年Lerner进一步推测:以过渡态类似物作为半抗原，则其诱发出的抗体即与该类似物有着互补的构象，这种抗体与底物结合后，即可诱导底物进入过渡态构象，从而引起催化作用。根据这个猜想Lerner和P．C.Schultz分别领导各自的研究小组独立地证明了:针对羧酸酯水解的过渡态类似物产生的抗体，能催化相应的羧酸酯和碳酸酯的水解反应。1986年美国Science杂志同时发表了他们的发现，并将这类具催化能力的免疫球蛋白称为抗体酶或催化抗体．同年，加州大学的P.Schuhz等宣布单克隆的MOPC167抗体可以催化对硝基苯氧基羧基胆碱的水解。3．抗体酶的结构性质抗体和酶一样是大分子蛋白质，由2条相同的轻链(大约2500D)和2条相同的重链(大约5000D)组成。(见图一)轻链由VL(可变区)和CL(不变区)组成，重链也由VH(可变区)和CH(不变区)组成。重链和重链及重链和轻链之间通过二硫键相连，此外重链还有一连接枢扭，抗体的结合部位由6个超变区组成，对同类型抗体CL和CH部分氨基酸的序列相同，然而VL和VH是非常专一的。可变区大约由110个氨基酸组成，至少可产生108个不同抗体，它是抗体多样性的基础。Fab片段由轻链和重链VH及CH1组成。抗体－抗原复合物是借助范得华力、疏水作用、静电作用及氢键作用而形成。3.2抗体酶的基本结构及性质抗体酶主要来自IgG抗体分子。对抗体结构分析表明:IgG分子是由2条相同的重链及2条相同的轻链靠二硫键连接而成。木瓜蛋白酶作用抗体后，产生3个片断，其中相同的2个片断为Fab;Fab中与抗原结合的部位，是高度可变区(Fv)，该部位广泛的结构及顺序变化决定了抗体对外来物质的识别特性，其中电荷互补及立体互补是其分子识别的主要特征。上海交通大学2抗体酶简介及医学上的应用4.抗体酶的特性抗体酶具有典型的酶反应特性;与配体(底物)结合的专一性,包括立体专一性,抗体酶催化反应的专一性可以达到甚至超过天然酶的专一性；具有高效催化性,一般抗体酶催化反应速度比非催化反应快104-108倍,有的反应速度已接近于天然酶促反应速度；抗体酶还具有与天然酶相近的米氏方程动力学及pH依赖性等。5.抗体酶的制备方法上世纪70年代中期单克隆抗体制备技术和基因工程技术的诞生以及80年代聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)技术的发明,为人工制备抗体酶铺平了技术道路。将抗体转变为酶主要通过诱导法、拷贝法、化学修饰法、引入法，基因工程定点突变法，细胞融合法等几种技术途径。5.1诱导法这是抗体酶的传统制备方法选择合适的反应过渡态类似物作为化学模型物,与载体蛋白偶联后免疫动物,使宿主产生抗体,再利用杂交瘤技术来筛选和分离,得到具有催化活性的单克隆抗体就是抗体酶用单克隆化的杂交瘤细胞就能进行单克隆抗体的扩大生产由于多数反应过渡态类似物的分子量较低,即半抗原本身的免疫原性很弱,必须与某种载体偶联才能表现免疫原性。所得到的抗体酶的催化能力的高低,在很大程度上取决于反应过渡态类似物,即半抗原的设计要求通过半抗原的设计,产生最优化的抗体催化剂,实现与免疫球蛋白结合口袋的互补。5.2拷贝法拷贝法主要根据抗体生成过程中抗原-抗体互补性来设计的,其过程见图2。首先,用已知的酶作为抗原免疫动物,通过单克隆技术,得到抗酶抗体。然后,再将此抗体作为抗原去免疫动物,再次采用单克隆技术,经筛选和纯化就可获得具有原来酶活性的抗体酶。因为抗原与该抗原产生的抗体具有互补性,经两次拷贝,就把酶的活性部位的信息翻录到抗体酶上了,使该抗体酶活性中心的空间结构与原酶的形状完全一致,保证了对同底物的特异性。酶第一次免疫第二次免疫抗体酶图2利用拷贝法制备抗体酶示意图5.3化学修饰法抗体酶和酶都可以用化学修饰法加以改造,关键是找到一种温和的方法在抗体结合位置或附近引入具有催化功能的基团。游离巯基就是适合的基团之一,它具有高亲和性,易于氧化,能通过二硫化物进行交换反应或亲电反应而选择性修饰的特点。一般先用可裂解亲和试剂与抗体作用,然后再用二硫苏糖醇处理,则在抗体的结合部位附近引入巯基,用此巯基作为锚可以很方便地引入其它化学功能团,如咪唑基等。用此法已制备出了含有活性部位巯基和咪唑基的具有水解活力的抗体酶[1-2]。此法不需要了解反应的过渡态及反应的详细机制,而且可以引入天然和人工合成的辅因子。5.4引入法引入法是借助基因工程和蛋白质工程将催化基团引入到特异抗体的抗原结合位点上,使其获得催化功能,是一种很有前途和发展潜力的抗体酶制备方法。可以将催化基团引入上海交通大学3抗体酶简介及医学上的应用到特异抗体的抗原结合位点上,也可以针对性地改变抗体结合区的某些氨基酸序列,以获得高效的抗体酶。这就可在细菌培养中繁殖数百万计不同抗体。随着噬菌体抗体库技术的完善,可根据需要构建适当序列的基因片断,绕过免疫学方法，构建全新的抗体酶。噬菌体表达技术与高效快速的筛选手段结合起来,将彻底改变抗体酶制备的传统途径。5.5基因工程定点突变法随着基因工程技术的发展。用基因工程方法改造和制备全新的抗体酶是一种很有前途和发展潜力的抗体酶制备方法。对于已产生的单抗，分析抗体结合部位的氨基酸顺序或对应的碱基顺序，然后通过对抗体酶结合部位氩基酸对应的基因序列进行定点突变，在抗体结合部位抉上有催化作用的氨基酸，进而改变抗体酶的催化效率。这就是基因工程法生产抗体酶的原理。5.6细胞融合法此方法是Schultz等首次使用的方法。其过程如下:要得到一特定抗原的抗体，如果抗原是小分子，必须将其和载体蛋白相联，然后对此抗原进行免疫，使宿主有机体针对抗原产生抗体产生抗体的脾脏细胞与骨髓细胞相融合。融合得到的杂交细胞既能产生抗体，又能在体外培养。通过选择培养，杂交细胞得以存留。将杂交体克隆化，即繁殖成母体的同一细胞或分离成菌落，这些菌落能够产生单一均匀的抗体。对这些菌落用酶联免疫吸收实验加以筛选，以评价其选择性结合抗原的能力。然后把抗原结合到一种固体支撑物上，再加入含有抗体的介质，这样抗原－抗体复合物随即形成，经过提纯就得到AB－AC复合物。6.抗体酶的应用6.1在有机合成领域的应用复杂天然产物的合成一直是有机合成中的热点之一。Sinha等第一次把抗体酶用于天然产物Multistriatin的合成。目前，已经成功筛选出可催化六种类型酶促反应和几十种化学反应的抗体酶，可催化许多困难和能量不利的反应．催化类型包括底物异构化反应、酯水解、酰胺水解、酰基转移、Claisen重排反应、光诱导反应、氧化还原、消除反应，金属螯合、环化反应等，抗体酶还可以作为手性助剂控制光加反应产物的立体化学，用于手性化合物的拆分，还可用于探索化学反应机制。6.2在戒毒领域的应用吸毒是一个困绕着很多国家的难题，尤其是吸毒上瘾后很难戒掉，直接拮抗可卡因上瘾的抗体至今还没有找到。一个替换的方法是阻断可卡因、鸦片和受体的结合。Landry等用可卡因水解的过渡态类似物一磷酸单酯为半抗原。产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解，其催化活性和血液中催化可卡因的丁酰胆碱酯酶差不多，水解后的可卡因片断失去了可卡因刺激功能。因此，用人工抗体酶的被动免疫也许能阻断可卡因上瘾，达到戒毒目的。6.3在前药设计中的应用前药(prodrug)又称前体药物或药物前提，是指药物某一基团在体外经选择性保护，然后在体内特定病灶部位脱保护而发挥治疗作用的一类药物。抗体酶的制备原理可用于前体药物设计和活化。6.4在医学领域的应用21世纪的生物技术药品主要由抗体、疫苗、反义核酸、基因治疗药物和多肽类药物等5类组成,抗体以它具有高度特异性和高度亲和力为优势,已被广泛用于癌症、急性心梗、哮喘、类风湿性关节炎、红斑狼疮、器官移植排斥反应、多发性硬化症、脓毒症和牛皮癣等疾病的治疗。目前,美国抗体制品的产值占整个生物技术药品产值的三分之二。抗体酶备受关注是因为它裂解抗原引起的抗原活性消失是永久性的,并且一个催化抗体能够裂解多个抗原分子。近年来抗体酶技术在各领域都有广泛的应用,在医学方面主要体现在戒毒和解毒;上海交通大学4抗体酶简介及医学上的应用肿瘤、艾滋病、甲状腺疾病的治疗，预防心脑血管疾病等领域。（1）用于抗肿瘤随着对抗体酶研究的深入进行，抗体酶越来越显示出其在医学领域中的潜在应用价值。人们利用抗体酶催化药物在体内的还原，有利于机体对药物的吸收，并降低药品的毒副作用;将抗体酶技术和蛋白质融合技术结合在一起，设计出既有催化功能又有组织特异性的嵌合抗体，用于切除恶性肿瘤;将抗体酶直接作为药物，以治疗酶缺陷症患者。目前正在发展一种称为抗体介导前药治疗(ADEPT)技术。前药是指为降低药物毒性而设计的一类自身无活性或活性较低，需要在体内经代谢转化为活性药物以发挥作用的化合物。抗体酶在正在发展的ADEPT体系中成功的对前药进行活化，提高了肿瘤治疗的选择性，显示出很好的应用前景。将能催化前药转化为肿瘤细胞毒剂的酶，与肿瘤细胞专性抗体相偶联，酶通过与肿瘤抗体的结合而存在于肿瘤细胞表面，当前药扩散至肿瘤细胞表面或附近时，抗体酶就会将前药迅速水解，释放出抗肿瘤药物。这样大大提高了肿瘤细胞附近局部药物的浓度，增强对肿瘤细胞的杀伤力，减少对正常细胞的杀伤作用。经科学家们的不断努力，抗体酶在癌症方面的应用将日益完善，有可能成为肿瘤治疗的重要武器。（2）抗爱滋病毒(HIV)HIV通过其核衣壳蛋白gpl20与T淋巴细胞CD4分子结合而侵染Th细胞,摧毁人体免疫系统,破坏免疫防御功能,患者并发症或肿瘤而死亡。SudhirPaul研究小组利用蛋白质工程方法制作出抗体酶,它能水解HIV的gpl20上编号为421-433的一小段肽序列。研究证明该序列具有高度的保守性,因而这种酶能辨识世界各地发现的几乎所有的HIV毒株,从而解决了HIV的多变性问题。目前,研究人员正研究将该抗体酶输入血液来开发HIV免疫疗法。这种抗体酶也能用作阴道或直肠局部用剂配方来防范经性传播而引起的HIV感染[3]。（3）治疗甲状腺疾病甲状腺激素是维持正常代谢和生长发育所必需的激素,包含两种含碘氨基酸:T(三碘甲状腺原氨酸)和T(四碘甲状腺原氨酸),T4脱碘转化为T3后具有生物学活性,反应由含硒的碘甲状腺原氨酸脱碘酶催化,缺乏该酶可导致体内T3含量不足,引起严重的甲状腺疾病。利用抗体酶技术模拟脱碘酶活性,有望治疗因缺乏该酶导致的甲状腺疾病。Lian等[4]以T4为半抗原合成了抗体酶Se-4C5,该酶具有很高的脱碘酶活性,对治疗甲状腺疾病有很高的应用价值,其作用机制为二底物乒乓机制。（4）预防心脑血管疾病谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase,GPX)是抗氧化酶系的重要成员之一,能有效清除自由基,对防治心脑血管疾病、肿瘤等具有潜在的应用价值。（5）其他方面Wentworth等[5]观察到抗体酶在催化水和单分子氧反应生成过氧化氢的过程中,生成了一种化学本质类似于臭氧的额外产物,可产生很强的杀菌作用;而在噬中性粒细胞释放过氧化氢的过程中这种物质也存在,提示体内存在催化此反应的抗体酶,这必将加深对机体免疫反应机制的认识,并为疾病的治疗带来新的契机。抗体酶在治疗有机磷神经毒剂中毒、清理血中代谢废物以及预防感染方面也发挥作用。Lacroix-Desmazes等[6]在研究抗体酶浓度与脓血症预后关系时发现,病人IgG催化活性比死者高得多。同时发现IgG不仅可以水解凝血因子Ⅷ,还可水解凝血因子Ⅸ,发挥溶栓作用,提示具有水解酶活性的抗体在出血性疾病预后方面发挥着重要作用。7.存在的问题尽管抗体酶研究取得了很大进展，离开实际应用仍有一段距离。首先是催化效率问题:目前所得的大部分催化抗体的反应速度加强只能是中等水平的，比酶催化低2—3个数量级;因此，如何提高抗体酶的催化效率是个挑战。其次是筛选问题:目前的筛选方法只能筛选上海交通大学5抗体酶简介及医学上的应用库中有用抗体的一小部分;一般是通过对半抗原结合力的大小来筛选的，而不是通过催化活性来筛选，可是对半抗原亲和力最大的不一定是最好的催化抗体—相信正在开发catELISA法能够解决这一问题。还有抗体酶专一性、底物抑制、催化基团最适装配等问题都等待人们去攻克。抗体酶是抗体与酶结合的产物，它的发展有赖于抗体与酶的结构的深入研究，特别是对酶作用机制的深入研究。8.总结总之，抗体酶是化学和生物学的研究成果在分子水平交叉渗透的产物，是抗体的多样性和酶分子的巨大催化能力结合在一起的一种新策略。抗体酶技术从诞生到现在虽然只有短短一二十年时间,却得到了飞速的发展,而且在医学领域越来越显示出广泛的应用前景和潜在的应用价值。抗体酶的研究,为人们提供了一条合理途径去设计适合于市场需要的蛋白质,即人为地设计制作酶。它是酶工程的一个全新领域。尽管抗体酶技术还存在如催化效率普遍较天然酶低等诸多方面的问题,抗体酶的研究存在很多不足之处，但随着制备技术的不断完善,以及对抗体酶结构和催化机制的不断认识,随着单克隆抗体技术的发展和酶的作用机制的阐明，相信抗体酶技术会逐渐成熟,并应用于疾病的预防、诊断、治疗及康复领域,在医学领域发挥更重要、更全面的作用。参考文献:[1]PollackSJ,NakayamaGR,SchultzPG.Introductionofnucleophilesandspectroscopicprobesintoantibodycombiningsites[J].Science,1988(242):1038-1040.[2]PollackSJ,SchultzPG.Asemisyntheticcatalyticantibody[J].JAmChemSoc,1989(111):1929-1931.[3]StephaniePlanquea,YasuhiroNishiyamaa,HiroakiTaguchia,etal.CatalyticantibodiestoHIV:Physiologicalroleandpotentialclinicalutility[J].AutoimmunRev.,2008,7(6):473-79.[4]LianGetal.JBiolChem,2001,276(30):28037-28041[5]WentworthPetal.Science,2002,298(5601):2195-2199[6]Lacroix-DesmazesSetal.ProcNatlAcadSciUSA,2005,102(11):4109-4113[7]范立梅，阮红．抗体酶的研究及应用［J］．温州大学学报，2005，18(4):51-54．[8]吕瑕慧，温哲．抗体酶的制备及应用［J］．科学论坛，2010，30;397[9]张江丽，王聪艳．抗体酶的研究进展［J］．JournalofLangfangTeachersCollege(NaturnalScienceEdition)，2009，9(2):65-67[10]陈苏婷．抗体酶的研究进展．中国科技论文在线[11]LarsenNAetal.Biochemistry,2004,43(25):8067-8076[12]DickersonTJetal.BioorgMedChem,2004,12:4981-4987上海交通大学6',)