基因工程原理讲义：目的基因的分离

('第十章目的基因的分离中国科学院遗传与发育生物学研究所第十章目的基因的分离一、引言1．基因分离技术发展简介2．基因分离技术迅猛发展的客观要求3．目的基因的分离二、分离克隆基因的若干主要方法1．应用核酸探针分离克隆的目的基因2．应用差别杂交法或扣除杂交法分离克隆的目的基因3．低丰度mRNA之cDNA末端的快速扩增RACE法4．根据蛋白质家族的保守序列鉴定新的相关基因5．通过表达载体分离特异的cDNA三、应用mRNA差别显示技术分离目的基因1．引言2．mRNA差别显示原理3．mRNA差别显示实验过程及其局限性四、DNA标签法分离目的基因1．原理2．转位子标签法3．T-DNA标签法五、酵终双杂交与单杂交体系1．酵母双杂交体系2．酵母单杂交体系3．酵母三杂交体系第十章目的基因的分离一、引言1．基因分离技术发展简介1.在上个世纪70年代中期已经具备了分离基因的能力这主要是取决于当时重组DNA技术的发展水平，特别是发展出了安全的寄主菌株和克隆载体：第一个安全的大肠杆菌寄主菌株——X1776品系的诞生第一批安全适用的克隆载体pM19和pBR322的问世在上述这两个条件的基础上，分子生物学家成功地克隆出第一批基因。2.在上个世纪70年代末期克隆基因分离的能力明显提高这主要应归功于基因克隆策略的改变。由于发展出了改良的寄主菌株和克隆载体，人们提出了先克隆cDNA再分离目的基因的新策略。3.在上世纪80年代克隆基因分离技术得到了进一步的提高20世纪80年代之后，由于如下技术的进步，使人们分离克隆基因的能力得到进一步提高，这些技术主要有如下几项：a.寡核苷酸合成技术的改良；b.操作RNA和DNA的酶学方法的进步；c.PCR技术的发展与应用；4.目前科学家们已经掌握了先进的分离克隆基因的能力就目前的能力而言，可以说几乎任何期望克隆和分离的目的基因都是有可能被分离出来的。其主要原因是：a.技术的进一步发展；b.基因组全测序工作的迅速进展与成功；c.未知产物的发育调节基因分离技术的发明，例如mRNA差别显示技术基因定位克隆技术DNA标签技术等2．基因分离技术迅猛发展的客观要求近年来基因分离技术的迅猛发展，特别是产物未知的发育调节基因分离技术的发展尤为迅速，已发展出了基因定位克隆技术、mRNA差别显示技术、DNA标签法分离目的基因的技术(包括T-DNA标签法和转座子标签法)、以及酵母双杂交和单杂交技术。有关这些技术我们在下面章节中，都将作详细的叙述。归纳起来，近年来基因分离技术迅速发展的主要原因有如下三点：A.人类基因组计划人类基因组的复杂性：MW=2.9×109bp，约有6×109核苷酸对和近100000个基因。经过千百万年的分化和繁衍，今天全世界有50多亿人口，因此人类基因之正常与异常的突变形式更是千百倍于基因的基本数目。1988年9月，美国最负盛名的分子生物学家，DNA双螺旋结构的发现者之一Watson在众望所归之下，接受美国卫生研究院的邀请出任“人类基因组解读计划”的负责人，开始了令全世界科技界瞩目的“基因圣战”。——这是场追猎人类致病基因的圣战。1992年4月10日下午1时，Watson在冷泉港实验室内将辞呈传真到华府卫生研究院给顶头上司BernadineHealy，希利在接到辞呈后不说一句慰留的话，立即批准。Watson辞职的原由分析：他们两人的冲突始于基因专利事件。Watson：是一位才华横溢的诺贝尔奖得主，在学术界极负众望。Healy：是一位哈佛医学院出身，从事科学行政工作多年，是美国生物医学界权倾一时的官员。Watson是一位典型的传统科学家，他主张科研应以增进人类福利为目的，因此科研成果应该与世人共享，不得私藏。面对当前的基因研究狂潮，他最担心的是会引发一阵淘金热，妨碍科学合作。Hearly观点恰恰相反，她最感兴趣的是如何将科学成果转换成技术及经济实力。在未征询Watson意见的情况下，径自提出有关基因专利的建议。专利事件引发了国际压力、预算争夺战、NIH内部政治生态复杂化，使Watson觉得不堪负荷。于是提前一年拂袖而去，回归研究天堂——冷泉港实验室。专利事件没有因人事更迭而顺利解决，研究所夹带的汹涌暗潮正一波又一波地展现出它的威力，基因研究已深深地介入人类社会的个个角落。人类基因组计划专利事件深深地激发人们去发展特异基因的克隆分离技术，成为基因克隆分离技术发展的强大动力。B.基因分离与农业育种全世界范围内的人口膨胀对粮食需求的增加，要求应用基因工程技术培育高产、抗病、抗逆的农作物新品种。农作物遗传转化技术的建立为基因工程在农业中的应用奠定了良好的基础。在80年代末90年代初期，随着植物基因工程研究的不断深入，绝大多数具有重要经济意义的农作物品种的遗传转化方法都已经建立。例如：(1)1992年，Nature杂志上发表了通过基因工程操作将耐寒植物品种的甘油-3-磷酸酰基转移酶基因转化进低温敏感的品种，结果改变了后者的膜脂组成，从而明显地增强了低温敏感品种的生存能力。(Nature,1992,356,710-713)(2)1992年，Science杂志上发表了将ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因导入土豆，成功地转化进土豆，从而导致在土豆的块茎中出现超量的淀粉的累积。(Science,1992,258,287-292)(3)抗病的转基因烟草的培育成功等。这些成功事例，使植物遗传育种学家清楚地认识到，经济作物的产量、质量、抗病性以及抗逆能力等许多优良品质特性，都可以通过业已成熟的遗传转化予以实现。但是局限于目前已经确定并克隆的具有优秀品质特性的基因寥寥无几，因而使得许多优良的经济作物之间无法产生更加完善的转基因作物。由此可见，转基因作物的培育，主要的制约因素已不是遗传转化技术，而在很大程度上是取决于植物基因克隆分离技术的进展。C.染色体cDNA全序列测定的局限性于已知的DNA序列中确定基因(寻找基因)有两种方法，其一是应用计算机分析法，比较综合数据库中不同物种的序列，其中保守序列可能是有关基因的编码区；其二是全序列筛查。这些办法有相当的困难。例如水稻叶绿体基因组全序列早已测定，其中仍有一些开放读码结构的编码产物是未知的。再如，酵母3号染色体DNA全序列中测出了共182个开放读码结构(ORF)，其中已确定有31个是存在于该染色体上的基因，29个与数据库中已知基因网络，另有122个的开放读码结构(占总数2/3强)还不了解它们的功能和生物表型。鉴检基因组中大量的DNA序列是所谓冗余的序列，也就是说基因组大部分序列并无重要的生物学功能，因此有的科学家争议说全序列测定是否有必要，并且认为全序列图并无多大研究价值。以上叙述表明：(1)一些有理论研究或生产应用价值的基因(如人类的致病性基因)仅占全序列的极少部分，按部就班地测序不可能优先筛选出这类基因；(2)基因组中大部分序列(至少在目前的认识水平上看)并无重要的生物学功能，而且1-2个个体的基因组全序列并不包含大量的有重要生物功能的正常多态序列和异常突变序列(这样看来全序列可能没有很大的研究价值)；(3)基因组全序列测定工作，耗资巨大，一般发展中国家的财力难以承受，而以美国为首的国家又提出所谓“基因专利”问题；(4)医疗卫生临床实践和农业生产中的优良品种的培育之迫切要求；正是居于上述这种种原因，国际上有关基因组研究的重点已从过去的全序列测定转向与表型相关的重要基因的克隆与分离。因而伴随着有关基因的克隆与分离的技术也得到相应的发展。这也可以说是，为什么我今天要作这个学术报告的原因所在。3．目的基因的分离1.构建了基因文库(诸如cDNA文库、基因组DNA文库、BAC库以及YAC库等待)，可以说是已经实现了基因的克隆，但并不等于完成了目的基因的分离；2.不论是基因组文库还是cDNA文库，事实上都是没有目录可查的“基因图书馆”，我们并不知道其中究竟哪一个克隆含有我们所需要的目的基因序列。(1)基因分离定义从适当类型的基因文库中，筛选出含有目的基因的特定克隆的过程，叫做克隆基因的分离，简称基因分离或目的基因的分离。(2)基因分离的主要步骤DNA文库的构建：DNA分子与载体的重组及转化寄主细胞；↓cDNA文库及基因组DNA文库的构建；探针分子的制备：↓同位素标记法及非同位素标记法菌落杂交及阳性克隆的筛选↓重组体克隆的鉴定↓核苷酸序列的测定↓酶切图谱的构建核苷酸序列的测定基因功能的鉴定(3)基因分离的主要方法基因分离可区分为产物已知的目的基因的分离，和产物未知的目的基因的分离两大类型基因分离的主要方法有：a.应用核苷酸探针分离克隆的目的基因；b.应用差别杂交或扣除杂交分离克隆的目的基因；c.应用PCR技术分离克隆的目的基因；d.应用mRNA差别显示技术分离克隆的目的基因；e.应用表达文库分离克隆的目的基因；f.应用DNA插入作用分离目的基因：T-DNA插入法分离目的基因转位子插入法分离目的基因g.应用酵母双杂交或单杂交体系分离目的基因；h.应用基因定位克隆技术分离目的基因。二、分离克隆基因的若干主要方法1．应用核酸探针分离克隆的目的基因根据已知的蛋白质序列设计合成的寡核苷酸探针如果没有天然的核苷酸的探针可用来筛选克隆，那么人们往往根据编码蛋白质氨基酸序列资料设计和合成探针，但这有两个问题：第一，寡核苷酸探针必须是特异地识别目的cDNA序列，而不会识别其它无关的cDNA序列。只特异地识别真核cDNA文库所有cDNA序列中一段唯一序列的寡核苷酸探针至少得由15-16个核苷酸组成。而我们通常使用的寡核苷酸探针的长度是17-20个核苷酸，因此这就要求我们至少得掌握有关蛋白质序列中6个连续核苷酸的氨基酸序列资料。第二，遗传密码的简并问题有些氨基酸可由多达6个不同的密码子编码，因此这6个氨基酸序列可以由许多不同的DNA序列编码。正是由于这个原因，寡核苷酸探针通常是以按各种可能的序列结构混合合成的寡核苷酸探针库(图7-6)。例如Leu即有6个不同密码子：UUA，UUG，CUU，CUC，CUA和CUG在这种寡核苷酸探针库中，只有一种寡核苷酸探针具有正确的基因核苷酸序列结构。这个方法一个不便之处是，序列正确的寡核苷酸探针仅占寡核苷酸文库分子群体的一小部分，蓁部分大量的其它寡核苷酸探针有可能同无关的cDNA杂交而产生出相法数量的“假阳性”。克服“假阳性”办法之一——“猜测体”探针的应用“猜测体”(Guessmers)的定义：猜测体(Guessmers)(merfromoligomer)是一种用于基因克隆的低简并性的寡核苷酸探针，其核苷酸序列是按已知氨基酸序列推导来的，但又采纳了据猜测最可能与目的基因配对的密码子。猜测体是一种较长的唯一的寡核苷酸序列，它是根据在特殊物种中密码子使用资料(数据)和推测，选择含有密码简并最少的蛋白质区段进行合成。使用猜测体的大量实验表明，猜测体中只要有83%的核苷酸能够同目的cDNA克隆杂交，那么其结果便是错误的核苷酸沿着杂交分子成丛排列，期间被能够同目的cDNA完全配对的长为10-12个核苷酸区段分隔开来。实验已经表明，如果彼此互作的区段较大，达成0-12个核苷酸，那么猜测体杂交作用强度就足以鉴定出阳性克隆。而如果错配的核苷酸是均匀地分布在探针分子的各个部位，那么这种猜测体就不会同目的cDNA杂交。图6-23根据蛋白质氨基酸序列合成寡核苷酸探针用作合成寡核苷酸探针依据的多肽分子，其中半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)各自都有两个密码子。据此合成的寡核苷酸，实际上是由8种不同序列构成的寡核苷酸库。所有这8种可能的寡核苷酸序列都能够编码这6种氨基酸。这个寡核苷酸库的复杂度(complexity)是根据17个而不是18个核苷酸推导出来的，因为最后一个密码子的第3个位置的核苷酸是简并的故被略去。图中还示出了应用“猜测体”分离目的基因的情况。克服“假阳性”的办法之二——PCR猜测体技术克服因使用混合寡核苷酸探针库造成“假阳性”问题的另一种有效的办法通过PCR反应和猜测体杂交相结合的筛选技术。例如：尿酸氧化酶基因(Zcrateoxidasegene)就是应用PCR技术和猜测体克隆的：按照常规的肽链氨基酸序列分析法测定了尿酸氧化酶氨基末端的一段32个氨基酸的序列结构↓根据此段氨基酸序列之两端推导的核苷酸数据合成两组简并的寡核苷酸引物库↓从猪肝提取总mRNA合成cDNA，供作以简并的两组寡核苷酸引物库作引物的PCR反应的模板进行扩增↓克隆PCR扩增产物，并用唯一的猜测体探针进行杂交鉴定(筛选)阳性克隆。此猜测体探针是根据位于两段引物之间的已知的32个氨基酸序列的中间部分推导而来加猜测而来的↓经核苷酸序列分析发现，在分离的克隆中有一段编码着全部32个氨基酸的插入序列，其两端(即相当引物位置的每一端)都有一段小的插入序列(见图7-7的资料)↓用这段含有真正尿酸氧化酶氨基酸的插入序列作探针，在严格的条件下筛选噬菌体cDNA文库，获得了全长2.2kb的cDNA，经鉴定是尿酸氧化酶克隆图6-24应用PCR-猜测体技术分离尿酸氧化酶的编码基因图中略去了有关尿酸氧化酶氨基末端的氨基酸测序、两组简并的寡核苷酸引物库的合成及PCR扩增等程序。(a)PCR扩增产物同质粒载体重组后转化给大肠杆菌菌株；(b)应用中间部位的猜测体探针作菌落杂交；(c)从阳性克隆中分离重组体质粒DNA；(d)从重组质粒DNA中切下插入序列供作杂交探针筛选cDNA文库；(e)挑取含全长尿酸氧化酶基因cDNA的阳性克隆，供进一步研究使用2．应用差别杂交法或扣除杂交法分离克隆的目的基因差别杂交与扣除杂交差别杂交(differentialbybridization)，又叫差别筛选(differentialecreening)。适用于分离经特殊处理而被诱发表达的mRNA之cDNA克隆。为了增加这个方法的有效性，人们又设计了扣除杂交(subtractivebybridization)技术。扣除杂交又叫扣除cDNA克隆(SubtractivecDNAcloning)，它是通过构建扣除文库(Subtractivelibrary)得以实现的。A．差别杂交差别杂交是用于克隆具有共同调节机理的彼此相关的基因家族的一种技术。同一家族中的基因在结构上可能有所不同，但它们在同样的细胞条件下全都能够表达。这些基因家族包括(例如)有：a.在特定组织中表达的基因；b.在细胞周期特定阶段表达的基因；c.受生长因子调节的基因；d.在特定的发育阶段表达的基因；差别杂交的技术基础很简单，它不需要任何有关目的基因的特殊序列信息。主要是产生两个细胞群体：在一个群体中该基因家族表达，在另一个群体中该基因家族不表达。生长因子调节基因(Growthfactor-regulatedgene)的克隆是差别杂交成功应用的一个典型例子。我们知道血清中含有生长因子，因此用血清处理处于静止期的细胞时，便会迅速诱导生长因子调节基因进行表达，实验的基本程序如下：分别从静止期的细胞培养物和血清激活3hr的细胞培养物分离poly(A)mRNA↓用从激活细胞中分离的poly(A)mRNA制备cDNA，构建以\uf06c噬菌体载体的cDNA文库↓同时复制(转移复制)两份硝酸纤维素滤膜：A组滤膜同血清激活细胞制备的cDNA探针杂交B组滤膜同静止期细胞制备的cDNA探针杂交↓放射显影底片比较找到只同A探针杂交(有较强的杂交信号)而不同B探针杂交的噬菌斑位置↓这些克隆证明带有编码由血清诱导的生长因子调节基因的mRNA图6-25重组体克隆的差别杂交筛选法(a)从表达和不表达目的基因mRNA的两个细胞群体中分别制备总mRNA；(b)以oligo(dT)引物或是短的寡核苷酸随机引物，将总mRNA反转录成放射性标记的探针；(c)碱水解除去RNA链；(d)用每种探针分子分别与cDNA文库杂交，该文库是由表达目的基因的细胞总mRNA构建的B．差别杂交的局限性差别杂交的主要局限性：a.第一，差别杂交灵敏度低：因为所用的杂交探针是从mRNA反转录成的cDNA群体，在这些标记探针中目的基因对应的标记的cDNA比例很低，以至于对于低丰度的mRNA之克隆就很难检测到。b.第二，差别杂交工作量大，需耗费大量时间：差别杂交需筛选大量的转移杂交滤膜和鉴定大量的噬菌斑或克隆片段。这样的工作量往往使研究者望而生畏。况且正如第一点所述，所得的结果假阳性仍占有很高的比例。c.第三，差别杂交重复性差：两套平行转移的滤膜之间，DNA的含量不均一，因此所得杂交信号强度亦不一致，需进行重新点杂交以作进一步阳性克隆的鉴定工作。d.第四，差别杂交花费金钱大：实验所用杂交滤膜以及同位素等都是十分昂贵的。因此差别杂交技术耗资严重，成本高昂，非一般实验室所能承受。C．扣除杂交差别杂交筛选法用于分离在激活的细胞中有高表达效率的基因有良好的效果，而对低丰度的mRNA则有困难。现在已经发展出许多种用于克隆低丰度mRNA的方法，例如吸收探针(absorbedprobes)和扣除文库(subtractedlibrary)法，以及低丰度mRNA的cDNA末端快速扩增法(RACE法)。下面以非常难以克隆的编码T-细胞抗源受体基因的cDNA为例，说明扣除杂交筛选技术的基本原理和操作过程：编码T细胞抗原受体的基因只在T细胞中表达，而不在B细胞中表达；B细胞同T细胞亲缘关系密切，但它不表达T细胞抗源受体1.T细胞——可表达T细胞抗源受体；B细胞——不表达T细胞抗源受体。2.此法的核心技术是使能够在两种类型细胞中同时表达的基因mRNA之cDNA形成双链分子，而只在一种细胞中表达的基因mRNA之cDNA仍保留链形式；过羟基磷灰石柱使两者分开。图6-26扣除杂交法分离克隆的目的基因(a)野生型及突变型DNA的切割；(b)DNA变性并与生物素标记探针杂交；(c)过生物素结合蛋白质柱；(d)PCR扩增；(e)连接转化形成克隆库从T细胞和B细胞分别制备poly(A)mRNA：T-poly(A)mRNAB-poly(A)mRNA↓以oligo(dT)作引物，T-poly(A)mRNA为模板合成cDNA链。用碱水解法从合成产生的RNA-DNA杂交分子中去除RNA链，留下与T-poly(A)mRNA互补的cDNA链↓将此单链cDNA同超量的B-poly(A)mRNA杂交：所有的能同时在T和B两类细胞中表达的T细胞基因的cDNA分子(大约有98%左右)都同B-poly(A)mRNA杂交形成DNA-RNA杂交分子；而不能在B细胞中表达的T细胞特异的cDNA(约占2%)不能形成DNA-RNA杂交分子，仍然是单链的cDNA↓将此混合物过羟基磷灰石柱(hydroxylapatidecolum)：这种柱使双链DNA分子及RNA-DNA分子保留下来，而游离的单链cDNA则过柱，分离的结果是DNA-RNA杂交分子结合在柱上，而游离的cDNA则通过柱流出↓回收T细胞特异的cDNA，转变成双链cDNA后再克隆到\uf06c噬菌体载体上构成cDNA文库，即获得T细胞特异的cDNA分子高度富集的约由5000个克隆组成的cDNA文库↓用扣除的cDNA探针筛选文库：即32P标记的T-cellcDNA被32P标记的B-CellcDNA扣除之后，用作探针筛选文库筛选到45个克隆，其中具有编码T-cellreceptor的克隆。注释：1．TCell：Tlymphocyte，即T淋巴细胞，即对细胞免疫性作出应答的一类淋巴细胞，包括细胞毒性T细胞和辅助性T细胞。(TCell执行细胞免疫功能，并调节其它免疫细胞如B淋巴细胞的生长与分化)。可表达T细胞抗源受体(Typeoflymphocyteresponsibleforcell-mediatedimmunity;includesbotycytotoxicTcellsandhelperTcells).2．Bcell：Blymphocyte，即B淋巴细胞。即制造抗体的一类淋巴细胞。(Typeoflymphocytethatmakesantibodies).不能表达T细胞抗源受体。3．Tcellreceptorgenes：T细胞受体基因。编码T细胞受体(TCR)多肽链可变区和恒定区的基因。3．低丰度mRNA之cDNA末端的快速扩增。RACE法。构建cDNA文库的头一步是分离细胞总RNA，然后从中分离出主要含mRNA的部分，经反转录酶作用形成cDNA。这是利用mRNA分子中3´端的poly(A)尾巴，将含有12-20个dT的寡核苷酸短片段杂交法，并以此作为反转录酶的引物起作用。A．反转录酶合成cDNA链有两个不便之处：1.第一，反转录酶的产物是RNA-DNA杂交分子我们必须将这种RNA-DNA杂交分子转变成可克隆到载体分子上去的双链cDNA分子。这些方法有：①从mRNA-DNA杂交分子转变成双链DNA分子的头一种办法是在新合成的cDNA末端形成一个发夹环(hairpinloop)。这可能是一种体外人工产物，它为第二链cDNA合成提供了十分方便的引物。由此产生的双链cDNA具有发夹环结构，需用专门作用于单链DNA的S1核酸酶切割。但由于用(S1)核酸酶处理它的消化作用会使许多期望的cDNA序列被修剪掉，这样产生的cDNA克隆便失去了mRNA5´端的许多信息。②从mRNA-DNA杂交分子合成双链DNA分子的第二种办法是使用E.coli的RNaseH酶一定能够识别mRNA-DNA分子，将其中的mRNA链消化成许多短片段。即在mRNA-DNA杂交分子的mRNA链上形成许多缺口(nick)，随后，E.coliDNA聚合酶便以这些缺口为起点合成DNA，结果这个过程除了mRNA5´端的一小部分序列外便被完全复制出cDNA链，但这条新cDNA链不是完全连续的，它含有许多缺口，可用ligase封闭，形成双链cDNA分子。2.第二，应用oligo(dT)引导cDNA合成的第二个不便之处是，它必须从3´端开始，因为反转录酶是无法到达mRNA分子的5´端，对于非常长(特长)的mRNA分子而言，这是个特殊麻烦的问题。因为在这种mRNA分子中，从poly(A)到5´帽结构之间有一段很长的距离。在反转录过程中往往会提前终止，PCR扩增也存在这样的问题。为了克服这个麻烦已经发展出随机引物cDNA合成法(RandomlyprimedcDNA)和RACE法(RapidamplificationofcDNAends)。即cDNA末端快速扩增法。B．RACE法所谓随机引物扩增法，是用根据许多可能的序列合成的6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段作引物合成cDNA，应用这种混合引物库，mRNA的反转录便可从许多位点开始，而不仅仅是从具有oligo(dT)引物的3´端开始。研究工作已经表明，对于特长mRNA分子之紧靠5´端的序列是比较容易用此法克隆的。下面简要介绍RACE法：低丰度mRNA的克隆始终是困扰分子生物学家的一个难题，上面提到应用oligo(dT)和反转录合成cDNA同样也有许多麻烦之处。而RACE技术正是为了解决这些困难而设计的一种用于获取mRNA分子末端信息，特别是5´端序列的有效方法。它具有如下几个方面的优点：a.速度快：两天之内便可获得cDNA克隆；b.灵敏度高：可扩增丰度低于0.00001%的RNA，甚至只有几个RNA分子亦可被检测出来；c.适用面广：可用于检测(研究)在特定发育阶段或环境下细胞中基因的不同表达状况；4．根据蛋白质家族的保守序列鉴定新的相关基因在重组DNA技术得到实用之前，蛋白质分子的一级结构是根据按经典的生物化学方法纯化的蛋白质，作了氨基酸序列分析之后确定，这显然是相当费时的麻烦的工作。重组DNA技术为分子生物学家提供了方便，我们能够从基因的核苷酸顺序推导出蛋白质的氨基酸顺序。因此人们积累的新的蛋白质的氨基酸序列的资料的数量便明显地上升，于是人们便可以根据所收集到的大量的蛋白质的基本数据，按照相同的(相近的)结构与功能将蛋白质分成不同的家族——蛋白质家族。对同一蛋白质家族内的不同蛋白质分子的氨基酸序列作了仔细的分析比较之后发现，在蛋白质家族内存在着具共同氨基酸序列的区段。这种区段对蛋白质的催化功能可能具有重要的意义，或者可能决定一种特殊的蛋白质结构——保守区。通常一段保守区是由彼此相邻的6-7个氨基酸组成，这样的一段氨基酸序列在长度上是适合于推导合成寡核苷酸探针库，用来克隆编码相关蛋白质的cDNA——寡核苷酸探针库。此法已成功地用来分离编码蛋白质激酶的cDNA，基本程序是这样的：已知在许多种蛋白质丝氨酸激酶(proteinserinekinases)中，都有一段由6个氨基酸组成的保守序列：即Asp-Leu-Lys-Pro-Glu-Asn天冬-亮-赖-脯-谷-天冬酰胺根据这一段保守氨基酸序列合成寡核苷酸(17-mer)的探针库，即17-mer简并的寡核苷酸探针库。与此相反，在蛋白质酪氨酸激酶(proteintyrosinekinases)类似区域的氨基酸序列则与此不同，因此不会被上述探针所识别。在筛选的80000个cDNA克隆中有89个克隆可与此17-mer的简并寡核苷酸杂交；在这89个当中又有19个克隆可与第二种共同序列(保守序列)合成的寡核苷酸探针库杂交，其19个克隆中又有3个作了DNA序列分析表明，其编码同丝氨酸激酶蛋白质家族其它成员之间都呈现高度的保守性。5．通过表达载体分离特异的cDNAA．表达载体(ExpressionVector)定义是一种特殊设计的克隆载体，当外源基因插入到这种载体之后便可以在寄主细胞中进行表达(Expressionvectarisacloningvectordesignedsothataforeigngeneinsertedintothevectorwillbeexpressedinthehostorganism.)高等真核生物的基因是无法在大肠杆菌中表达的，因为它们的启动子结构不同，因而大肠杆菌的RNA聚合酶是无法作用于真核基因启动子的。可见外源真核基因在大肠杆菌中(转入大肠杆菌之后)便失去活性的原因十分简单，因为大肠杆菌细胞中的表达体系无法识别真核的表达信号。解决这个问题的办法是将外源的真核基因插入在载体的适当位置使之置于E.coli表达信号的控制之下，于是外源基因便能够在E.coli细胞中正确地转录和转译，能够提供这些信号的克隆载体，因而它便可用来产生重组蛋白质，这样的载体便叫做表达载体(expressionvector)。B．表达文库的建立(Constructionofexpressionlibrary)当没有可用的核苷酸序列作为筛选基因文库的引物时，一个变通的办法是将cDNA克隆在表达载体之上，再导入大肠杆菌寄主细胞，如此便构成了表达文库，然后通过在寄主细胞中蛋白质产物鉴定真核目的cDNA克隆。用于构建表达文加的克隆载体可以是从质粒载体，也可以是从噬菌体发展出来的表达载体。然而与核酸杂交克隆不同，表达克隆要求将外源真核的cDNA插入在置于表达载体上原核启动子的控制下，而且要求按正确的取向和阅读框架插入，以保证产生出正确的蛋白质。表达载体中的启动子通常是使用可调节的细菌启动子(regulatedbacterialpromoters)。表达的蛋白质可以按融合蛋白质形式合成，其中原核蛋白质的氨基酸序列是整合在真核蛋白质的一个末端，在细菌中，融合蛋白质通常要比真核蛋白质稳定(即不易被原核细胞中的有关蛋白酶所消化)，因而可以获得较高的表达水平。C．表达文库的筛选如核酸筛选一样，表达克隆的载体既可以是质粒也可以是噬菌体载体。同样地，表达文库的筛选也是先将之转移复印到硝酸纤维滤膜上。↓滤膜的第一步处理是使菌落或噬菌斑中的蛋白质暴露出来，然后使之仍含有期望蛋白质之抗体的溶液混合，温育适当时间。↓漂洗滤膜去除未结合的抗体，加入第二种抗体或葡萄球菌A蛋白(StraphylococealproteinA)去确定第一种抗体的结合位置。↓第二种抗体可以是放射标记的，也可以是同生物素偶合的，或是同某种酶(如碱性磷酸酶)结合的。根据这些由第二种抗体提供的标记(如放射性标记)观察可表达被特异抗体识别的蛋白质之克隆的位置。↓经对比，从原初平板上挑取阳性克隆，分离质粒或噬菌体DNA进行测序鉴定。图利用抗体筛选表达文库。如果有一种现成可用的蛋白质抗体，便可用它来筛选特异的cDNA文库。在噬菌体载体\uf06cgt11中，克隆位点EcoRI是位于E.colilacZ基因编码区中，如果外源DNA序列是按照正确的取向和阅读框架插入的，它们便可形成由\uf062-半乳糖苷酶和cDNA产物蛋白质构成的融合蛋白。当培养平板上的噬菌体发育成斑之后，每个斑中都含有大量的由噬菌体产生的融合蛋白质。噬菌斑中的这些融合蛋白质被转移复制到硝酸纤维素滤膜上，其中含有正确的融合蛋白质的噬菌斑位置可以用抗体鉴定。在通常的情况下，这是通过将滤膜与抗体溶液一道保温进行的。经过这样的处理，抗体便同已经吸附在滤膜上的融合蛋白质紧密地结合在一起。通常是用能够识别第一种抗体的经放射性标记的第二种抗体同此滤膜一道温育，以此来揭示出结合抗体(第一种抗体)所在的位置。图6-28利用抗体筛选表达文库(a)把原初平板上生长的噬菌斑及其产生的融合蛋白质原位复印转移到硝酸纤维素滤膜上；(b)滤膜与第一抗体溶液一道温育，漂洗后加放射性标记的第二抗体继续温育；(c)放射自显影。三、应用mRNA差别显示技术分离目的基因1．引言1.高等真核生物基因的类别：根据表达特性的差别，高等真核生物的基因可以分为两大类：①看家基因(house-keepinggene)以其组成型表达模式维持细胞的基本代谢活动②发育调节基因(developmentalregulatedgene)以其时空特异性表达模式完成个体的正常的生长、发育与分化。2.基因的差异表达：真核生物基因(的总数若按100000个计算)一般在每一定特定的发育阶段、某一特定的细胞类型中，只有15%左右的基因得以表达。因此若按100000个计算，则每一特定发育阶段、某一特定细胞类型中则只有15000个左右的基因表达产生出约15000种的mRNA；若按40000个基因计算，则只6000种mRNA。这种在生物个体发育的不同阶段，或是在不同的组织或细胞中发生的不同基因按时间、空间进行有序表达的方式，叫做基因的差异表达(differentialexpression)。生物的发育与分化、细胞的周期变化、生物体对外界环境压力的反应、以及个体的衰老与死亡等所有的生命过程，都可归结于基因的差异表达。不仅如此，就连正常的代谢过程的变化或是病理的变化，不管它是由单基因控制的，还是由多基因控制的，本质上也都是由于基因表达的改变造成的。因此说，比较不同细胞或不同基因型在基因表达上的差异，即mRNA种类的差别，为我们深入了解生命的过程，特别是发育过程的分子本质打开了方便之门。3.mRNA差别显示PCRmRNA差别显示PCR(mRNAdifferentialdisplayreversetranscriptionpolymerasechainreaction)。简称DDRT-PCR，即mRNA差别显示。2．mRNA差别显示的原理1.几乎所有的真核基因mRNA分子的3´-末端都有一段poly(A)尾巴。因此，在RNA聚合酶作用下，可按mRNA为模板，以oligo(dT)为引物合成出cDNA拷贝。2.根据mRNA分子3´-端序列结构分析，在这段poly(A)序列起点碱基之前的两个碱基，除了倒二位的碱基为A的情况之外，只能有如下12种可能的排列组合：5´-AGAAAA-3´5´-CGAAAA-3´5´-GGAAAA-3´5´-TGAAAA-3´5´-ATAAAA-3´5´-CTAAAA-3´5´-GTAAAA-3´5´-TTAAAA-3´5´-ACAAAA-3´5´-CCAAAA-3´5´-GCAAAA-3´5´-TCAAAA-3´3.3´-端锚定引物这是P.Liang等人根据上述mRNA分子结构特征设计的，用以反转录mRNA合成第一链cDNA的下游引物，共12种。其通式为：5´-T11MN或5´-T12MN其中T11或T12表示11个或12个连续的T核苷酸，M表示除T以外的任何一种核苷酸，即A、G、C，N表示任何一种核苷酸，即A、T、G、C。由此可见MN(3×4)总共只有12种不同的排列组合方式。这样每一种此类人工合成的3´-端锚定引物，都能够把总mRNA群体的1/12分子反转录成mRNA-cDNA杂种分子。由此可知，使用5´-T11MN引物或5´-T12MN引物，可以将整个mRNA群体在cDNA水平上，分成大致相等的位序列结构不同的12个分亚群体。4.5´-端随机引物由于3´-端锚定引物合成的第一链cDNA群体中，代表某一特定细胞类型或发育阶段的mRNA种的含量是相当低的，所以要把一种只在某一发育阶段或某种细胞类型中表达、而在另一发育阶段或某种细胞类型中不表达的目的基因分离出来，就需要进行PCR扩增，因此在DDRT-PCR反应中还需5´-端随机引物。5´-端随机引物理想长度是10个核苷酸，它可以同特定细胞类型的总mRNA群体中的一部分分子发生杂交作用，而且其杂交部位是分布在距每条新合成的cDNA链3´-端的不同位置上。3．mRNA差别显示实验过程及其局限性a.mRNA差别显示实验过程分离总mRNA(两组)↓使用3\uf0a2-端锚定引物反转录合成第一链cDNA↓用5\uf0a2-端随机引物——3\uf0a2-端锚定引物对，以及放射性同位素标记的dNTP，以第一步反转录合成的第一链cDNA作模板进行PCR扩增↓扩增的PCR产物，在变性DNA序列胶中作电泳分离，并作放射自显影↓切离并回收差别表达的DNA条带，并用同一引物对作第二次PCR扩增，和重组克隆↓Southern和Northern杂交，测序，鉴定出目的基因片段↓用此目的基因片段作探针全长cDNA或基因组DNA↓结构分析与功能鉴定最终获得目的基因图6-DDRT-PCR反应的基本程序(a)分别从A组和B组提取总mRNA；(b)加入3-端锚定引物(5\uf0a2-T11MN-3\uf0a2)进行反转录合成第一链cDNA；(c)加入一对特定组合的5\uf0a2-端随机引物和3\uf0a2-端锚定引物(5\uf0a2-T11MN-3\uf0a2)，以及35S-dNTP进行PCR扩增；(d)将同位标记的(即所谓热的)PCR产物加样在变性的DNA序列胶中作电泳分离，并作放射自显影图片。除了A组或B组特有的条带之外，大部分条带是两组共有的。b.mRNA差别显示技术的优点：可以同时比较多个样品间基因表达的差异；可以同时检测到“上游”及“下游”基因；检测的灵敏度高，所需样品少，一些低丰度的mRNA亦可被检测出来；结合使用PCR和序列胶电泳分析两项技术，使本法更加简单方便；c.mRNA差别显示技术的缺点：假阳性比较高，据有人测算在差别显示的DNA条带中，假阳性的比例通常可高达50%-70%；扩增条带的分子长度比较短小，一般均在110-450bp之间；工作量大，理论统计为分离一种差别表达的基因应检测的差示组为80\uf0b43=240对反应；d.高比例假阳性的原因分析长度一样或接近的PCR扩增产物在序列胶中的泳动速率相同，因此在同一条差示带中，实际上可含有多种的DNA序列；在序列胶中差示条带与其邻近条带之间在位置上十分接近，因此对片取胶时操作困难容易出错；绝大多数差示条带都仅含有3\uf0a2-UTR中的一个短片段信息，而与其编码区相比3\uf0a2-UTR相对保守，因此以差示条带作探针容易出现的假阳性；总RNA虽经DNaseI处理，但仍微量DNA污染，造成假阳性；5\uf0a2-端随机引物扩增产生的假阳性条带。\uf0a2\uf0a2\uf0a2差异条带选择原则：选择反差明显的真正差异特别是有无表达的条带极为重要；具有polyA尾巴的差异条带；长度至少超过150bp以上的、特别是300bp以上的差异表达条带；四、DNA标签法分离目的基因1．原理：DNA标签法(DNAtagging)，是根据DNA的插入作用发展出来的一种分离基因的方法，其依据的原理是：1.当一段特定的DNA插入到基因组中目的基因的内部、或其邻近位点时，便会诱发该基因发生突变，并最终导致表型变化，形成突变体(突变植株)；2.如果此段DNA插入序列是已知的，那么它便可以用来作为DNA杂交的分子探针，从突变体植株的基因组DNA文库中筛选到突变的基因；3.利用此突变基因作探针，就能从野生型植株的基因组DNA文库中克隆出野生型的目的基因；由于插入的DNA序列相当于人为地给目的基因加上一段已知的序列标签，因此DNA插入突变分离基因的技术，又叫做DNA标签法。应用DNA插入突变分离基因的技术，近年来获得了迅速的发展，已成为克隆植物基因的有效手段之一，它主要包括转位子标签法(transposontagging)和T-DNA标签法(T-DNAtagging)两种类型：2．转位子标签法a.转位子标签法的概念：转位子的转位插入作用，使被插入的目的基因发生突变失去活性，而转位子的删除作用又使目的基因恢复活性。根据转位子的这种特性发展出来的分离基因的新方法，叫做转位子标签法。同源转位子标签法(homologoustransposontagging)：用内源转位子分离同源寄主基因，叫做同源转位子标签法。异源转位子标签法(heterologoustransposontagging)：利用在分子水平上研究得比较清楚的外源转位子，分离异源寄主基因的技术，叫做异源转位子标签法。植物特别适合于应用转位子标签法分离目的基因：①由转位子转位作用导致的基因突变，可以保留在杂合子的植株中，而通过F1代植株自交产生的F2代植株中，便可获得纯合子的突变体植株。②这种杂交可以大规模地进行，特别是拟南芥、金鱼草这样的模式植物。由于它们具有：(a)植株个体小；(b)世代时间短；(c)种子数量多，等优点，因而可以获得庞大的子代群体，供筛选突变体植株使用。b.转位子标签法分离目的基因的程序使转位子在适宜的条件下转位插入到目的基因序列中↓用已知的转位子序列作探针，分离因转位子插入而发生了突变的基因↓以突变基因中包围转位子的侧翼序列作探针，分离野生型的目的基因c.金鱼草花茎基因(flo)的分离下面以金鱼草花茎基因(flo)为例详细说明应用转位子标签法分离植物基因的原理及具体步骤。为此，首先得弄清如下两点：第一，金鱼草中flo基因的突变会使花分生组织转变为另一枝花序分生组织，后者的花分生组织不会转变为新一枝的花序分生组织，如此反复循环，周而复始，不断地持续下去，形成无花的金鱼草突变株。由此可见，分离flo基因对于揭示花形态建成的分子机现，无疑是一项很有意义的研究工作。第二，Tam3是目前研究得较为详细的一种金鱼草转位子，其MW=3.6kb，金鱼草的flo基因就是应用(Tam3系transposonofAntirrhinummajus的缩写)这个转位子作标签分离到的。具体的分离程序：将具有Tam3转位子的金鱼草种植有15℃的温室中。(15℃Tam3转位作用的频率要比在25℃下高1000倍)↓自花授粉，观察F1代植株的花发育及形态特征↓从40000株中发现了一株无花(不能形成花)的金鱼草突变株flo-613↓以Tam3作探针分别与flo-613突变株(Flo-)基因组DNA及野生型亲本植株(Flo+)基因组DNA作Southern杂交(DNA经HindⅢ消化)↓结果显示在flo-613突变株基因组DNA中确实存在一条MW=7.5kb的额外条带(见图7)。这说明该基因组的flo基因序列中确实插入了一个Tam3转位子↓应用Tam3作探针，筛选flo-613突变株基因组DNA文库，得到一个含有7.5kbHindⅢ片段的阳性克隆↓序列分析表明此段7.5kb之HindⅢ片段含有tam3转位子及其插入位点两侧的flo基因的编码序列↓应用此部分的flo基因编码序列作探针，筛选野生型植株(Flo+)的cDNA文库，得到一个cDNA阳性克隆。↓根据其核苷酸序列推导的氨基酸序列，作同源性比较分析表明，它同任何已知的蛋白质均无关系，由此断定分离到了野生型的flo基因。图7金鱼草无花突变株flo-613基因组DNA之Southern分析A道：野生型金鱼草DNA，B道：flo-613基因组DNA注：图7中除了额外的7.5kbHindⅢ条带外，还有许多其它的阳性杂交条带，这是因为在金鱼草基因组DNA中，含有多拷贝的Tam3转位子序列的缘故。c.转位标签法的局限性优点：转位子标签法是目前分离植物基因的有效手段之一，特别是对于那些①编码产物未知的发育调节基因、②代谢调节基因以及③环境应答基因的分离，往往可以收到其它基因分离法难以收到的效果。缺点：①转位子标签法只适用于存在着内源活性转位子的植物种类。遗憾的是自然界此类植物种类并不多，特别是遗传系统已经作了深入研究的重要模式植物-拟南芥和番茄等，——均未发现有活性转位子。对此虽然可用转化的异源转位子予以克服，但异源转位子的转位插入作用往往是不稳定的，容易发生删除作用。图8flo-613突变体之开花的回复突变体自花授粉后代基因组DNA的Southern分析基因组DNA经HindⅢ酶切消化和琼脂糖凝胶电泳分离后，与同位素标记的Tam3DNA探针作Southern杂交。其中A、B、C三道均为flo-613(Flo-)突变型；D道为回复突变型(Flo-)；WT道为野生型(Flo+)图9拟南芥菜的野生型花及突变型花的结构及其模式图(a)野生型花；(b)ag-1突变型花；(c)野生型花模式图；(d)ag-1突变型花模式图②转位子转位插入突变的频率比较低，而且植物基因组中还常常存在着过多拷贝的转位子序列。因此此法实验周期长、工作量大、需花费大量的人力和财力。③转位子的转位插入作用有可能导致致死突变，或者是由于多基因控制的某种性状，转位插入造成的单基因突变，就不足以使植株产生明显的突变性状。因此，在诸如上述这类情况下，应用转位子标签法，事实上是难以分离到我们所期望的目的基因的。薛勇彪博士工作简单：应用转位子插入突变技术寻找影响花粉S基因表达的突变体，由此分离S基因，通过突变50000个花粉，获得一个只影响S1在花粉内特异表达的突变体pmal。并证明pmal突变是因S等位基因在花粉中的重复造成的。3．T-DNA标签法在高等植物中，也是一种非常有效的诱变剂和基因的分子标签，尤其是对拟南芥菜基因的分离十分有用。a.T-DNA标签法原理一般认为T-DNA可以随机地插入到高等植物核基因组的不同位置。在拟南芥菜中，用T-DNA标签法可以产生35%-40%的突变率，其中有19%的突变体具有外观可觉察到的表型特征。——T-DNA具高频转移和随机插入受体细胞染色体基因组的能力。在T-DNA标签中，可通过在T-DNA序列中插入一个报告基因或一个增强子，以有利于对转化的原生质体或是培养的细胞进行筛选。b.T-DNA标签法分离拟南芥菜目的基因ag基因(agamousgene)——拟南芥无花基因，参与花器官的形态建成；ag-1——应用化学诱变剂EMS处理拟南芥种子，得到开异型花的拟南芥突变体植株；ag-2——应用T-DNA标签法得到的开异型花的拟南芥突变体植株；EMS：乙基甲磺酸(ethyemethanesulfonate)；拟南芥野生型化：4萼片、4花瓣、6雄蕊、2心皮；拟南芥异型化：4萼片、10花瓣、心皮转变为花，从而形成了既无雄蕊也无雌蕊的、花中有花的异型花；NPTII基因：卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶基因；应用T-DNA标签法分离拟南芥AG基因程序：构建在T-DNA两翼(LB和RB)之间含有一个NPTII基因的Ti质粒载体↓用含有此种重组Ti质粒的根瘤土壤杆菌感染同萌发的拟南芥种子一温育(转化频率低，但你可获得一定的转化子)↓用目测法从转化种子成长的植株中筛选出抗卡那霉素的具异型花表型的ag-2突变株↓经检测发现在此ag-2突变株基因组DNA中的AG基因序列中存在着插入的T-DNA序列↓这段插入的%-DNA序列，含有一个大肠杆菌的ori起点，和一个Ampr基因，但没有SalI切点↓用SalI酶切割ag-2突变株基因组DNA，就会产生出两端带有部分AG基因序列的T-DNA片段↓分离此T-DNA片段→再环化→导入E.coli细胞中增殖↓挑选Ampr的转化子，并分离克隆的AG基因部分序列作探针↓从拟南芥野生型植株的cDNA文库和cosmid基因组文库中，分别筛选得到野生型AG基因的cDNA克隆和基因组克隆↓将此编码AG基因的cosmid克隆导入ag-2突变株的细胞，由此再生的植株开正常的花。说明此cosmid克隆确实编码着完整的野生型的AG基因。(图)图10T-DNA标签法分离拟南芥菜AG基因流程图五、酵母双杂交与单杂交体系1．酵母双杂交体系酵母双杂交体系(two-hybridsystem)是九十年代初期在转录因子结构基础上发展起来的一种敏感的体内鉴定基因的方法。它可有效地用来分离能与一种已知的靶蛋白(targetprotein)相互作用的另一种蛋白质的编码基因。(1)转录因子的两个主要结构域：a.DNA结合域-DNAbindingdomain，简称DNA-BD，它可识别效应基因上游的一段特定的区段，即上游激活序列(up-streamactivatingsequence,UAS)，并与之结合。b.转录激活域-Transcriptionalactivationdomain，简称AD，它通过同转录机(transcriptionmachinery)中的其它成分的结合作用，启动UAS下游的基因进行转录。(2)酵母半乳糖苷酶基因的转录因子-GAL4在GAL4的N端1-147位氨基酸区有一个DNA结合域(DNA-BD)；在GAL4的C端768-881位氨基酸区有一个转录激活域(AD)；DNA-BD和AD这两个结构域，可以通过DNA重组技术将它们彼此分开。如果把它们(两者)放置在同一寄主细胞中表达，由此产生的GAL4DNA-BD和GAL4AD多肽，彼此之间就不会直接发生相互作用，所以不能激活其相关的效应基因进行转录。应用重组DNA技术，也可以将来自同一个转录因子的、或是两种不同转录因子的、分开的两种结构域(即DNA-BD和AD)在体内重新组装成具有功能的转录因子，从而激活UAS下游启动子调节的报告基因进行表达。(3)酵母双杂交体系(i)构建两种E.coli-yeast穿梭质粒载体穿梭质粒质粒(shuttlevector)：是一类人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号、因而可在两种不同寄主细胞中进行复制和存留的质粒载体。这种质粒可以携带外源DNA在原核细胞和真核细胞中往返穿梭。1.第一种质粒载体pGBT9，这种质粒又叫做DNA-BD质粒载体(具Trp基因)DNA-BD质粒载体(具色氨酸TRP的编码基因Trp)↓靶基因按正确取向和读码结构插入在该质粒载体的多克隆位点上↓靶蛋白与GAL4-BD多肽发生融合作用↓形成第一种杂种蛋白质(X)2.第二种质粒载体pGAD424，又叫AD质粒载体，它具有亮氨酸基因(leu)，是用来构建cDNA表达文库的专用载体。AD质粒载体(具leu基因)↓克隆的cDNA片段按正确的取向和读码结构插入的AD质粒载体的多克隆位点上↓构成cDNA表达文库↓cDNA编码蛋白质与GAL4-AD多肽融合图酿酒酵母质粒载体pGBT9的形体图GAL4bd=GAL4结合域序列；P=启动子；T=转录终止序列；▲=GAL4核定位信号形成第二种杂种蛋白质(Y)图酿酒酵母质粒载体pGBT9的形体图GAL4bd=GAL4结合域序列；P=启动子；T=转录终止序列；▲=GAL4核定位信号图酿酒酵母质粒载体pGAD424的形体图GAL4ad=GAL4激活域序列；P=启动子；T=转录终止序列；▲=SV40大T抗原核定位信号(ii)酵母双杂交体系的寄主菌株人们将酿酒酵母基因组中的GAL4的编码基因剔除掉，发展成酵母双杂交体系转化系统的寄主菌株。例如SFY526和HF7c等。SFY526菌株：a.丧失了表达内源GAL4转录因子的能力；b.具有lacZ报告基因；c.trp1和leu2转化标记，也就是说在缺少Trp和Leu的培养基中无法生长；HF7c菌株：a.丧失了表达内源GAL4转录因子的能力；b.具有His3和LacZ报告基因；c.Trp1和leu2转化标记，也就是说在缺少Trp和Leu的培养基中无法生长。(iii)共转化大肠杆菌细胞中分别提取杂种质粒I和杂种质粒II，并共转化酵母菌株(例如)HF7c。↓涂布在SD培养基(dropoutmedium)上，该培养基缺少His、Leu和Trp三种氨基酸，以便筛选那些表达相互作用的杂种蛋白质的菌落。1.如果靶子蛋白质同一种由文库编码的蛋白质发生了相互作用，这样便构成了一种有功能的GAL4转录因子。2.这种有功能活性的GAL4转录因子能识别GAL4效应基因的上游激活序列(GAL4UAS)，从而启动下游报告基因(lacZ或His3表达)。3.若使用的报告基因是lacZ便可通过显色反应筛选出阳性克隆。2．酵母单杂交体系(1)原理酵母单杂交体系是一种体内分析系统，用于分离与顺式作用调控元件结合的特定蛋白质之编码基因。许多真核转录因子都是由结构上可以分开的、功能上相互独立的两个结构域组成，(即DNA-lindingdomain,BD和activationdomain,AD)。特别值得注意的是，当这两个结构域分开时，DNA结合域BD仍可与调控序列结合；而转录激活域AD当其靠近转录起始复合物时，仍可以启动基因转录。根据这种特点，人们设想用一种未知蛋白质取代BD来和AD形成融合蛋白质。如果此未知蛋白质能够与调控序列结合，它就可以携带AD靠近转录起始复合物，从而启动基因转录。根据这一个原理，可能通过检测报告基因的表达情况，来鉴定未知蛋白质能否与调鬼斧神工序列结合。通过筛选未知蛋白质cDNA-AD表达文库，可以分离和鉴定新的DNA结合蛋白质(DNA-BindingProtein,DNA-BP)的编码基因。图3-1单杂交基因原理示意图(2)实验程序(i)重组报告质粒的构建把所要研究的调控元件(例如生长素的应答元件AuxRE，连接成多聚体形式↓插入到报告质粒(例如pHISi或pLacZi)中报告基因的上游部位，相构成含有调控元件的重组的报告质粒(例如pHISi-AuxRE4及PlacZi-AuxRE4)。pHISi报告质粒和pLacZi报告质粒是由Clontech公司设计的可整合到酵母基因组的报告质粒载体↓将重组的报告质粒pHISi-AuxRE4转化酵母菌株YM4271↓转化混合物涂布在SD/-His营养缺陷型培养基上，筛选阳性克隆↓YM427[pHISi-AuxRE4]菌株用同样的方法构建重组的报告质粒载体pLacZi-AuxRE4,并转化到酵母YM4271菌株，形成YM4271[pLacZi-AuxRE4]↓将pLacZi-AuxRE4重组质粒载体转化YM4271[pLacZi-AuxRE4]菌株↓采用SD/-His固体培养基筛选阳性克隆，获得新酵母菌株YM4271[pHISi-AuxRE4+pLacZi-AuxRE4](ii)实验程序-表达文库的构建我我们实验室采用：a.Stratagene公司生产的HybriZAP-2.1XR文库构建试剂盒；b.以Hybri-ZAP\uf06c噬菌体载体；c.取解调控48h的胡萝卜体细胞胚作材料；cDNA表达文库的构建：mRNA的分离与纯化↓第一链cDNA的合成↓第二链cDNA的合成，同时参入同位素↓加EcoRI接头，过Sepharose(L-4B柱，除去小分子量(400bp以下)DNA分子↓与\uf06c噬菌体载体Hybri-ZAP重组、连接、包装↓构成\uf06c噬菌体cDNA表达文库内删除作用：\uf06c噬菌体载体与质粒载体相比，显得分子量较大，不便于克隆基因的鉴定以及制备构建和测序等。将插入在\uf06c噬菌体载体上的外源DNA克隆到质粒载体上是一种烦琐的过程。具有体内删除特性的\uf06c噬菌体载体，能够在体内将插入的DNA片段从\uf06c载体转移到质粒载体。\uf06cZAP载体就是具有内删除特性的典型代表。\uf06c噬菌体载体结构特点：在\uf06cZAP载体的基因组中，含有一个可以在体内发生内删除作用的pBluescript噬菌粒的DNA片段‖这个DNA片段的两侧分别是f1单链噬菌体的终止子(T)和起始子(I)‖pBluescriptDNA内部有一段其两端分别带有T3及T7噬菌体启动子的多克隆位点(MCS)区‖外源DNA在MCS区插入，导致lacZ基因失活，为重组子提供组化检测手段；外源DNA按正确取向和读码结构插入，则可形成融合蛋白质；内删除作用原理：当含有外源DNA插入序列的重组的\uf06cZAP载体感染了大肠杆菌F+菌株(更经常是F1菌株)，之后，再用辅助噬菌体M13或f1超感染。‖在感染的细胞内由辅助噬菌体M13基因II提供的反式作用蛋白质，便会识别\uf06cZAP载体臂上的f1DNA合成起点I，并在其(+)DNA链上切成一个缺口。‖接着从此缺口处开始沿着pBluescript序列按滚环模型进行单向性的(+)链的DNA合成。当其到达f1终止子(它与I具有相同的切割位点序列)时，便会被基因II蛋白质再次切割。‖结果此(+)DNA链的两端便会连接形成一个环形的单链的pBluescript噬菌粒基因组。从而完成了内删除作用的全过程。它最终被M13的蛋白质包装成单链的DNA噬菌体颗粒，亦被挤压出寄主细胞。‖培养物经过离心得上清，置70℃加热20分钟，结果：a.E.coli细胞死亡；b.\uf06c噬菌体死亡；c.包装着pBluescriptDNA的M13颗粒具有热抗性，存活下来；‖将此特殊的M13再感染F1大肠杆菌细胞，并涂布在含Amp的平板上，选择抗性克隆，便得到pBluescript噬菌粒。因为进入F1大肠杆菌细胞内的pBluescript(+)DNA链，通过环形DNA合成被转变成双链的噬菌粒DNA之后，便能如同质粒一样从ColE1复制起点进行正常的DNA复制。cDNA表达文库的筛选：通过内删除作用将噬菌体文库转变成噬菌粒文库↓提取噬菌粒(文库)的DNA，转化酵母菌株YM4271[pHSi-AuxRE4+PhlacZi-AuxRE4]↓转化混合物涂布在SD/Leu/-His+45mM3-AT的培养基上，筛选阳性克隆。(3-AT=3-amin9-1,2,4-triazole)↓在我们的实验中，从大约106个转化子中筛选出共15个阳性克隆供进一步分析鉴定。图\uf06cZAP载体的结构及其体内删除作用酵母三杂交体系(Y3H)1.概念前已提到，酵母双杂交体系的最大局限性在于，它只能检测两种蛋白质之间的相互作用。然而在大多数情况下，例如，真核细胞信号传导途径中存在着多种蛋白质分子之间的联系，它常常需要第三种蛋白质分子参与修饰蛋白质之间的相互作用。因为有时候两种蛋白质因子之间需要一种共同的支架蛋白才可以真正相互结合，发生作用。酵母三杂交体系(yeastthree-hybridsystem,Y3H)是在酵母双杂交基础上发展出来的一种用以研究三种蛋白质因子之间相互作用的方法。2．原理真核基因的转录活性是由特异性转录因子调控的。在结构上，转录因子可区分为DNA结合域BD和转录激活域AD两个彼此结合又相互独立的组成部分。AD、BD和启动区的顺式元件之间，需通过共价或非共价的连接建立起一定的空间联系之后，方能延相关基因转录。根据上述这种事实可以设想，如果将两种能够与第三种“接头蛋白”发生相互作用的蛋白质X和Y，以分别与BD及AD形成融合蛋白质的形式表达于转化的酵母菌株中，并分布在细胞核内，那么通过“接头蛋白”与X及Y蛋白质之间的相互作用，便可以将B帮AD两种结构域从空间上拉近，形成有功能活性的转录因子与上游激活序列结合，从而调控报告基因的表达。在X蛋白质和Y蛋白质是已知的情况下，用之筛选相应的基因文库时，就可以获取大量的与已知蛋白质因子相互作用的未知的新的蛋白质，即所谓的“接头蛋白质”因子。3．酵母三杂交原理示意图图6酵母三杂交基本原理示意图AD：GAL4ActivationDomain;BD:DNABindingProtein;UAS:Upstreamactivatingsequence',)