高效液相色谱法习题,高效液相色谱法操作步骤

('第12章高效液相色谱法习题（一）选择题单选题1.在高效液相色谱中影响柱效的主要因素是()A涡流扩散B分子扩散C传质阻力D输液压力2.在高效液相色谱中，提高柱效能的有效途径是()A提高流动相流速B采用小颗粒固定相C提高柱温D采用更灵敏的检测器3.高效液相色谱法的分离效果比经典液相色谱法高，主要原因是()A流动相种类多B操作仪器化C采用高效固定相D采用高灵敏检测器4.在高效液相色谱中，通用型检测器是()A紫外检测器B荧光检测器C示差折光检测器D电导检测器5.HPLC与GC的比较，可忽略纵向扩散项，这主要是因为()A柱前压力高B流速比GC的快C流动相黏度较小D柱温低6．液相色谱定量分析时，要求混合物中每一个组分都出峰的是()A外标标准曲线法B内标法C面积归一化法D外标法7．下述四种方法中最适宜分离异构体的是是()A吸附色谱B反离子对色谱C亲和色谱D空间排阻色谱8．在液相色谱中，梯度洗脱适用于分离()A异构体B沸点相近，官能团相同的化合物C沸点相差大的试样D极性变化范围宽的试样9．在HPLC中，范氏方程中对柱效影响可以忽略不计的因素是()A涡流扩散B纵向扩散C固定相传质阻力D流动相传质阻力10．当用硅胶为基质的填料作固定相时，流动相的pH范围应为()A在中性区域B5一8C1一14D2一811．高效液相色谱法中，常用的流动相有水、乙腈、甲醇、正己烷，其极性大小顺序为()A乙腈>水>甲醇>正己烷B乙腈>甲醇>水>正己烷C水>乙腈>甲醇>正己烷D水>甲醇>乙腈>正己烷12．高效液相色谱法中,使用高压泵主要是由于()A可加快流速，缩短分析时间B高压可使分离效率显著提高C采用了细粒度固定相所致D采用了填充毛细管柱13．液相色谱的H-u曲线（）。A与气相色谱的一样，存在着HminBH随流动相的流速增加而下降CH随流动相的流速增加而上升DH受u影响很小14.与气相色谱相比，在液相色谱中（）。A分子扩散项很小，可忽略不计，速率方程式由两项构成B涡流扩散项很小，可忽略不计，速率方程式由两项构成C传质阻力项很小，可忽略不计，速率方程式由两项构成D速率方程式同样由三项构成，两者相同15．液相色谱中不影响色谱峰扩展的因素是（）。A涡流扩散项B分子扩散项C传质扩散项D柱压效应16．在液相色谱中，常用作固定相又可用作键合相基体的物质是（）。A分子筛B硅胶C氧化铝D活性炭17．样品中各组分的出柱顺序与流动相的性质无关的色谱是（）。A离子交换色谱B环糊精色谱C亲和色谱D凝胶色谱18．高效液相色谱法中，对于极性成分，当增大流动相的极性，可使其保留值（）。A不变B增大C减小D不一定19．在反相色谱法中，若以甲醇-水为流动相，增加甲醇的比例时，组分的容量因子k与保留时间tR的变化为（）。Ak与tR增大Bk与tR减小Ck与tR不变Dk增大，tR减小多选题20．下列检测器中，不属于高效液相色谱中的检测器是（）A紫外检测器B氢火焰离子化检测器C荧光检测器D氮磷检测器E示差折光检测器21．化学键合固定相具备下列何种特点（）A固定液不易流失B选择性好C不适用于梯度洗脱D柱效高E易和组分形成氢键吸附22．高效液相色谱法中，不能用于梯度洗脱实验的检测器为（）A紫外检测器B示差折光检测器C荧光检测器D电化学检测器23．梯度洗脱是将两种或两上性质不同但能互溶的溶剂，按一定的程序连续改变其配比进行洗脱，此方式可改变（）A流动相的极性B流动相的温度C被测组分的分离效果D流动相的流速24．在高效液相色谱法中，选择流动相时应注意（）A对被分离的组分有适宜的溶解度B黏度大C与检测器匹配D与固定相不互溶25．评价高效液相色谱柱柱效的指标是（）A理论塔板高度B分配比C理论塔板数D分离度26．高效液相色谱法的定量指标为（）A相对保留值B峰面积C峰高D半峰宽27．高效液相色谱中，提高流动相的流速可以（）A减少涡流扩散B降低保留时间C改变相对保留值D增大传质阻力项28．下列因素影响高效液相色谱塔板高度的是（）A固定相粒度B流动相的流速C色谱柱长度D色谱柱直径29．高效液相色谱法分离不同组分的先决条件是（）A色谱柱要长B流动相流速要大C各组分的分配系数不等D理论塔板数要多（二）填空题1．高效液相色谱仪一般由、、、、和等部分组成。2．高效液相色谱中常用的检测器主要包括、、、、和等。3．高效液相色谱中的洗脱方式主要包括和，其中类似于气相色谱中的程序升温，前者连续改变的是流动相的，而不是温度。5．高效液相色谱的类型主要包括、、、和等。6．在液－液分配色谱中，对于亲水固定液采用流动相，即流动相的极性___________（大于或小于）_固定相的极性称为正相分配色谱。7．正相分配色谱适用于分离化合物、极性（大或小）的组分先流出、极性（大或小）的组分的后流出。8．流动相常用的脱气方法有、和。9．高效液相色谱中的高压泵按工作原理分为和两大类。11．离子对色谱法是把加人流动相中，被分析样品离子与生成中性离子对，从而增加了样品离子在非极性固定相中的，使增加，从而改善分离效果。14．高效液相色谱法中，如果色谱柱超载则会造成柱效_______，峰形变________。17．在液相色谱中，为改善分离度并调整出峰时间，可通过改变流动相和______的方法达到。18．在液相色谱中，速率理论方程中的项很小，可忽略不计，VanDeemter方程式可写成。19．通过化学反应，将键合到表面，此固定相称为化学键合固定相。21．液相色谱流动相应使用（高或低）黏度溶剂，可减小溶质的，有利于提高柱效。22．在液相色谱中，色谱特别适合于分离异构体，洗脱方式适用于分离极性变化范围宽的试样。23．以ODS键合固定相，以甲醇一水为流动相时的色谱为色谱（正相或反相）。24．用凝胶为固定相，利用凝胶的与被分离组分分子间的相对大小关系，而分离、分析的色谱法，称为空间排阻（凝胶）色谱法。凝胶色谱的选择性只能通过选择合适的来实现。25．在正相色谱中，极性的（强或弱）组分先出峰，极性的（强或弱）组分后出峰。（三）判断题1．荧光检测器是高效液相色谱法的通用型检测器。（）2．检测器性能好坏将对组分分离产生直接影响。（）3．面积归一化法只能适用于检测器对所有组分均有响应的情况。（）4．高效液相色谱中常采用程序升温来提高分离效果、改善峰形、降低检测限。（）5．VanDeemter方程用于高效液相色谱时，Cu项可以忽略不计。（）6．在液相色谱中为避免固定相的流失，流动相与固定相的极性差别越大越好。（）7．在反相高效液相色谱中，流动相的极性较固定相大。适合于分离极性较性组分。（）8．流动相的黏度影响高效液相色谱柱柱效，黏度越小，柱效越高。（）9．高效液相色谱法采用梯度洗脱，是为了改变被测组分的保留值，提高分离度。（）10．示差折光检测器是属于通用型检测器，适于梯度淋洗色谱。（）11．化学键合固定相具有固定液不易流失，传质速度快，柱效高，热稳定性好，选择性好等特点，可用梯度洗脱。（）12．液相色谱的流动相又称为淋洗液，改变淋洗液的组成、极性可显著改变组分分离效果。（）13．高效液相色谱法中，若采用内标法进行定量时，选用的内标物应为样品中不含有的纯物质。（）14．高效液相色谱能分离的物质都不能用气相色谱法分离。（）15．在液相色谱中，流动相的流速大小对柱效影响不大。（）16．液相色谱的H-u曲线与气相色谱的H-u曲线一样，流速都存在一个最低点。（）17．液相色谱的中引起色谱扩展的主要原因是纵向扩散项。（）18．正相键合色谱的固定相为非（弱）极性固定相，反相色谱的固定相为极性固定相。（）19．用凝胶色谱分离样品时，若分离情况很差，可考虑改变流动相的组成以改善分离效果（）20．高效液相色谱中，流动相的流速越大，传质阻力项越大，柱效越低。（）21．紫外检测器因对流动相温度和流速非常敏感，所以不能用于梯度洗脱。（）22．高效液相色谱法中使用的最多的固定相为化学键合固定相，它是用化学反应的方法将固定液的官能团键合在载体表面上而形成的。（）23．化学键合固定相包括非极性、中等极性和极性三类，广泛使用的十八烷基（C18或ODS）键合固定相为非极性，用于分离非极性及中等极性的物质。（）24．高效液相色谱所用的流动相，一般要经过纯化及脱气处理。（）25．在反相高效液相色谱法中，流动相的极性增强，组分的分配比k及保留时间tR则会减少。（）26．高效液相色谱柱中存在的流动相的传质阻力，包括在流动的流动相及静态的流动相中的传质阻力。（）（四）简答题1．提高高效液相色谱的柱效的关键在哪里？2．高效液相色谱法中化学键合固定相有哪些优点？3．简述高效液相色谱仪主要部件及其作用。4．高效液相色谱常用检测器有哪几种，其适用范围是什么?5．从分离原理、仪器构造及应用范围上简要比较气相色谱及液相色谱的异同点。6．液相色谱中影响色谱峰展宽的因素有哪些?与气相色谱相比较,有哪些主要不同之处?7．液-液分配色谱和液-固分配色谱的分离原理分别是什么？分别适宜分离何种物质？8．化学键合相色谱、离子交换色谱、空间排阻色谱的分离机理分别是什么？分别适合分离何种物质？9．什么是正相色谱和反相色谱？10．什么是梯度洗脱？试比较梯度洗脱与气相色谱中的程序升温之间的异同点？（五）计算题1．用高效液相色谱法分离甲、乙两组分，测得甲的保留时间为4.65min，半峰宽为0.15min；乙的保留时间为6.60min，半峰宽为0.22min。试计算该色谱柱对甲、乙两组分的理论塔板数、平均理论塔板数和两组分的分离度。（15376，14400，14888，5.27）2．在25cm长的柱上分离A、B混合物，A物质保留时间为15.20min，峰底宽1.11min；B物质保留时间为16.63min，峰底宽1.21min；不保留物1.30min流出色谱柱。计算：（1）A、B两峰的分离度；（2）平均理论塔板数及理论塔板高度；（3）分离度如要达到1.5，柱长应为多少？（1.23；2999，3022，3011；27.5cm）3．准确称取样品0.100g，加入内标物0.100g，测得待测物A及内标物的峰面积分别为51430，84153。已知待测物及内标物的相对校正因子分别为0.80、1.00。计算组分A的百分含量。(48.89%)4．高效液相色谱法测定某复方药M中有效成分A和B的含量，采用内标对比法定量。精密称取M片剂的质量，求得平均片重m1=0.5012g，然后称取片剂的细粉m2=0.5010g，加入内标物S的质量(ms)样品=0.0350g，经适当处理制备成100mL混合溶液（样品溶液）。另按药典中该药的片剂处方含量，称取对照品成分A0.2200g，成分B0.1500g，内标物(ms)对照=0.0350g。三种纯品经适当处理制备成100mL混合溶液（对照品溶液）。经测定，对照品溶液各组分的峰面积均值为：A(154900)、S(171200)、B(692300)；样品溶液各组分的峰面积均值为：A(178000)、S（202700）、B（820900）。计算：（1）M片剂中A、B的标示量（%）。(97.1%,100.2%)（2）M片剂中A、B的含量mA、mB(0.2136g,0.1503g)第二十章高效液相色谱法思考题和习题1．简述高效液相色谱法和气相色谱法的主要异同点。相同点：均为高效、高速、高选择性的色谱方法，兼具分离和分析功能，均可以在线检测不同点：分析对象及范围流动相的选择操作条件GC能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，占有机物的20%流动相为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小加温常压操作HPLC溶解后能制成溶液的样品，高沸点、高分子量、难气化、离子型的稳定或不稳定化合物，占有机物的80%流动相为液体或各种液体的混合。它除了起运载作用外，还可通过溶剂来控制和改进分离。室温、高压下进行2．何谓化学键合相？常用的化学键合相有哪几种类型？分别用于哪些液相色谱法中？采用化学反应的方法将固定液键合在载体表面上，所形成的填料称为化学键合相。优点是使用过程不流失，化学性能稳定，热稳定性好，适于作梯度淋洗。目前常用的Si-O-Si-C型键合相，按极性分为非极性，中等极性与极性三类。①非极性键合相：常见如ODS键合相，既有分配又有吸附作用，用途非常广泛，用于分析非极性或弱极性化合物；②中等圾性键合相：常见的有醚基键合相，这种键合相可作正相或反相色谱的固定相，视流动相的极性而定：③极性键合相：常用氨基、氰基键合相，用作正相色谱的固定相，氨基键合相还是分离糖类最常用的固定相。3．什么叫正相色谱？什么叫反相色谱？各适用于分离哪些化合物？正相色谱法：流动相极性小于固定相极性的色谱法。用于分离溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质，用于含有不同官能团物质的分离。反相色谱法：流动相极性大于固定相极性的色谱法。用于分离非极性至中等极性的分子型化合物。4．简述反相键合相色谱法的分离机制。典型的反相键合色谱法是用非极性固定相和极性流动相组成的色谱体系。固定相，常用十八烷基（ODS或C18）键合相；流动相常用甲醇-水或乙腈-水。非典型反相色谱系统，用弱极性或中等极性的键合相和极性大于固定相的流动相组成。反相键合相表面具有非极性烷基官能团，及未被取代的硅醇基。硅醇基具有吸附性能，剩余硅醇基的多寡，视覆盖率而定。对于反相色谱的分离机制\ue5e5目前，保留机制还没有一致的看法，大致有两种观点，一种认为属于分配色谱，另一种认为属于吸附色谱。分配色谱的作用机制是假设混合溶剂（水十有机溶剂）中极性弱的有机溶剂吸附于非极性烷基配合基表面，组分分子在流动相中与被非极性烷基配合基所吸附的液相中进行分配。吸附色谱的作用机制可用疏溶剂理论来解释。这种理论把非极性的烷基键合相，看作是在硅胶表面上覆盖了一层键合的十八烷基的"分子毛"，这种"分子毛\'有强的疏水特性。当用水与有机溶剂所组成的极性溶剂为流动相来分离有机化合物时，一方面，非极性组分分子或组分分子的非极性部分，由于疏溶剂作用，将会从水中被＂挤＂出来，与固定相上的疏水烷基之间产生缔合作用，其结果使组分分子在固定相得到保留。另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，使它离开固定相，减小保留值，此即解缔过程，显然，这两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。一般说来，固定相上的烷基配合基或被分离分子中非极性部分的表面积越大，或者流动相表面张力及介电常数越大，则缔合作用越强，分配比k\'也越大，保留值越大。不难理解，在反相键合相色谱中，极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。5．离子色谱法、反相离子对色谱法与离子抑制色谱法的原理及应用范围有何区别？离子色谱法(IonChromatography)：用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相。以电导检测器为通用检测器。试样组分在分离柱和抑制柱上的反应原理与离子交换色谱法相同。离子色谱法是溶液中阴离子分析的最佳方法，也可用于阳离子分析。反相离子对色谱法(IPC或PIC)：反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分与其中的反离子形成中性离子对，增加k和tR，以改善分离。适用于较强的有机酸、碱。反相离子抑制色谱：在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相pH值，抑制组分解离，增加其k和tR，以达到改善分离的目的。适用于极弱酸碱物质（pH=3~7弱酸；pH=7~8弱碱；两性化合物）6．亲和色谱的分离机制是什么？有何特点？传统的观念认为亲和色谱是基于配基-配体亲和反应的原理，利用色谱的差速迁移理论，实现对目标分子的分离，仅仅是一种组分分离的选择性过滤法。然而，这一理论是建立在配基-配体亲和作用是均相反应和宏观平衡态热力学的基础上的。但是，实际上目标分子在两相间分配系数过大，且在固定相上的吸附等温线多不呈线性。所以，关于生物大分子在亲和色谱中的保留机制及色谱过程数学模型的研究一直是一个相对薄弱的环节，有待进一步的完善.亲和色谱具有较高的专属性，经其分离，纯化，浓集后的生物样品具有较高的纯度，大大降低了后续测定(如HPLC)时的背景噪音，进而使得后续测定具有极高的灵敏度。7．速率理论方程式在HPLC中与在GC中有何异同？如何指导HPLC实验条件的选择？解:液相色谱中引起色谱峰扩展的主要因素为涡流扩散、流动的流动相传质、滞留的流动相传质以及柱外效应。在气相色谱中径向扩散往往比较显著，而液相色谱中径向扩散的影响较弱，往往可以忽略。另外，在液相色谱中还存在比较显著的滞留流动相传质及柱外效应。在高效液相色谱中，对液液分配色谱，VanDeemter方程的完整表达形式为由此，HPLC的实验条件应该是：①小粒度、均匀的球形化学键合相；②低粘度流动相，流速不宜过快；③柱温适当。8．试讨论影响HPLC分离度的各种因素，如何提高分离度？(1)色谱填充性能液相色谱柱分离性能的优劣，是由固定相粒度、柱长、由柱内径和填充状况决定的柱压降这三个参数度决定的。这三个参数度也决定了样品组分的保留时间，保留时间不仅与色谱过程的热力学因素k有关，还直接与决定柱效与分离度的柱性能参数及流动相的黏度有关，这些参数都是影响色谱分离过程动力学的重要因素。但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般都是购买商品柱，很少自行制备。(2)流动相及流动相的极性液相色谱中，改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接因素。液相色谱不可能通过增加柱温来改善传质。因此大多是恒温分析。流动相选择在液相色谱中显得特别重要，流动相可显著改变组分分离状况。(3)流速流速大于0.5cm/s时，H～u曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。9．试讨论反相HPLC的分离条件的选择。反相HPLC法是以表面非极性载体为固定相，以比固定相极性强的溶剂为流动相的—种液相色谱分离模式。反相HPLC色谱中样品的保留值主要由固定相比表面积、键合相种类和浓度决定，保留值通常随链长增长或键合相的疏水性增强而增。溶质保留值与固定相表面积成正比，当其他条件相同时，溶质在低表面积色谱柱上的保留值短。样品的保留值也可以通过改变流动相组成或溶剂强度来调整，溶剂强度取决于有机溶剂的性质和其在流动相中的浓度。10．在正、反相HPLC中流动相的强度是否相同？在正相色谱中，由于固定相是极性的，所以溶剂极性越强，洗脱能力也越强，即极性强的溶剂是强溶剂。在反相色谱中，由于固定相是非极性的，所以溶剂的强度随溶剂的极性降低而增加，即极性弱的溶剂是强溶剂。11．什么叫梯度洗脱？它与GC的程序升温有何异同？在一个分析周期内，按一定程序不断改变流动相的组成或浓度配比，称为梯度洗提。是改进液相色谱分离的重要手段。梯度洗提与气相色谱中的程序升温类似，但是前者连续改变的是流动相的极性、pH或离子强度，而后者改变的温度。程序升温也是改进气相色谱分离的重要手段。12．蒸发光散射检测器的原理及特点是什么？蒸发光散射检测器（EvaporativeLight-scatteringDetector）是通用型检测器，可以检测没有紫外吸收的有机物质，如人参皂苷、黄芪甲苷等。一、ELSD原理恒定流速的色谱仪（高效液相、逆流色谱、高效毛细管电泳等）洗脱液进入检测器后，首先被高压气流雾化，雾化形成的小液滴进入蒸发室(漂移管，drifttube)，流动相及低沸点的组分被蒸发，剩下高沸点组分的小液滴进入散射池，光束穿过散射池时被散射，散射光被光电管接收形成电信号，电信号通过放大电路、模数转换电路、计算机成为色谱工作站的数字信号——色谱图。二、特点1．洗脱液需要雾化，所以雾化气流的纯度和压力会影响检测器的信噪比。2．流动相要蒸发掉，所以不能使用不易挥发的物质来调节流动相的pH值。可以通过蒸发温度的调节来使比被测物质沸点低的组分蒸发。在不使被测物质蒸发的前提下，温度越高，流动相蒸发越完全，色谱图基线越好、信噪比越高。如果被测物质沸点接近或低于流动相的蒸发温度，则无法检测；不过，100%的水做流动相，蒸发室温度也才设为150摄氏度，沸点比水低的有机物质完全可以用气相色谱仪进行分离检测了。由于流动相和溶剂蒸发了，使用ELSD检测器收集的色谱图一般没有溶剂峰；而且梯度洗脱没有折光视差效应，一般不会出现基线漂移。3.检测光散射变化，所有进入到散射池的物质都可被检测，而且响应值只与物质的量有关。4.浓度跟峰面积不成线性，分别取自然对数后成线性。13．常用的HPLC定量分析方法是什么？哪些方法需要用校正因子校正峰面积？哪些方法可以不用校正因子？常用的HPLC定量分析方法有：外标法：外标工作曲线法、外标一点法、外标二点法等内标法：内标工作曲线法、内标一点法、内标二点法、内标对比法等使用内标和外标标准曲线法时，可以不必测定校正因子，其它方法须要用校正因子校正峰面积14．指出苯、萘、蒽在反相色谱中的洗脱顺序并说明原因。三者极性顺序从大到小是苯、萘、蒽，因此在反相色谱中的洗脱顺序为苯、萘、蒽，苯最先出峰。15．宜用何种HPLC方法分离下列物质？（1）乙醇和丁醇；（2）Ba2+和Sr2+；（3）正戊酸和正丁酸；（4）高摩尔质量的葡糖苷。（1）正相键合相色谱法（2）离子交换色谱法（3）离子对色谱法（4）空间排阻色谱法16．欲测定二甲苯的混合试样中对-二甲苯的含量。称取该试样110.0mg，加入对-二甲苯的对照品30.0mg，用反相色谱法测定。加入对照品前后的色谱峰面积(mm2)值为，对-二甲苯：40.0，104.2；间-二甲苯：141.8，156.2。试计算对-二甲苯的百分含量。（20.0%）17．计算例2中炔雌醇的校正因子及含量。（3.02,0.0369mg/片）18．测定黄芩颗粒中的黄芩素的含量，实验方法同例1。测得对照品溶液（5.98µg/ml）和供试品溶液的峰面积分别为：706436和458932，求黄芩颗粒中黄芩素的含量。（1.55%）19．测定生物碱试样中黄连碱和小檗碱的含量，称取内标物、黄连碱和小檗碱对照品各0.2000gcm2。称取0.2400g内标物和试样0.8560gcm2。计算试样中黄连碱和小檗碱的含量。（黄连碱26.2%，小檗碱27.3%）20．计算在反相色谱中甲醇-乙腈-水(60:10:30)的强度因子。如果改用四氢呋喃-甲醇-水，水的含量不变，为了保持相同洗脱强度，甲醇的比例是多少?(2.12，68.7%)21．用15cm长的ODS柱分离两个组分。柱效n=2.84×104m–1；测得t0=1.31min；组分的min；=4.45min。(1)求k1、k2、α、R值。(2)若增加柱长至30cm，分离度R可否达1.5?((1)k1=2.13、k2=2.40、α=1.13、R=1.33，(2)R=1.88，能)',)