超氧化物歧化酶(SOD)过氧化物酶(CAT)苯丙氨酸解氨酶(PAL)实验测定方法总结

('超氧化物歧化酶（SOD）活性测定-----氮蓝四唑（NBT）法依据测定的蛋白含量计算出不同品种葡萄所需的酶液量（mL），并按照表2顺序加入试剂，注意核黄素要最后加入，共做6管。表2NBT法测定SOD酶活性50mMpH7.8磷酸缓冲液（mL）130mM甲硫氨酸溶液（mL）750μM氮蓝四唑溶液（mL）100μMEDTA-Na2（mL）蒸馏水（mL）酶粗提液（mL）20μM核黄素溶液（mL）13.20.60.60.60.400.623.20.60.60.60.400.633.180.60.60.60.40.020.643.180.60.60.60.40.020.653.180.60.60.60.40.020.663.180.60.60.60.40.020.6注：1号为不光照对照管，2号为光照对照管各溶液显色反应用量混合后，将1号管置于黑暗处，其余各管置于光照处，反应约10min（温度低时，反应时间延长；光照强时，缩短反应时间）。反应结束后，全部移入暗处，以不光照对照管作为空白对照，在560nm处测定吸光度，记录数据。以每变化0.1个吸光度为一个酶活单位SOD酶活计算公式：SOD（U/Pr.mg)=(Ack-Ae)/(Ack0.1C)式中：C-蛋白含量（mg）Ack-用缓冲液代替酶液的照光对照管吸光度Ae-样品管吸光度试剂配制方法：（1）0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。91.5ml0.05MNa2HPO4（1.638582g）+8.5ml0.05MNaH2PO4(0.06630425g)（2）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml。（3）750µmol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。（4）100µmol/LEDTA-Na2溶液：称取0.03721gEDTA-Na2，用磷酸缓冲液定容至1000ml。（5）20µmol/L核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml，避光保存。过氧化物酶（CAT）活性测定----紫外吸收法取6只试管，其中两个为对照管，依据测定的蛋白含量计算出不同品种葡萄所需的酶液量（mL），并按照表3加入试剂。表3紫外分光发测定CAT酶活性0.2MpH7.8磷酸缓冲液（mL）蒸馏水（mL）酶粗提液（mL）1（对照）1.71021.510.231.510.241.510.251.510.225℃预热后，逐管加入0.6mL0.1M的H2O2。每加完一管立即计时，并迅速倒入石英比色皿中，在260nm下测定吸光度，每隔2min读数一次，共测12min,待4个管全部测完。记录数据，计算活性。以1min内A240减少0.01的酶量为1个酶活单位（u）CAT活性计算公式(U/g.Pr/min)=△A240/(C0.01t)式中：△A240=A240(ti)—A240(tt)C—蛋白含量0.01—A240每下降0.01为1个酶活单位（u）；t—加过氧化氢到最后一次读数间的时间（min）。试剂配制方法：（1）0.2MpH7.8磷酸缓冲液：0.2mol/LNa2HPO491.5ml(6.553962g)+0.2mol/LNaH2PO48.5ml(0.265217g)(2)0.1MH2O2：（30%的H2O2溶液5.68mL稀释至1000Ml）SOD同工酶研究取200uL酶粗提液，按照1：1（v/v）的比例和样品溶解液混合，室温放置15-30min。装置好垂直电泳制胶器，然后按照表4做分离胶。先倒入分离胶，大约倒到距离梳子有1cm停止，加入蒸馏水对分离胶进行水封，使胶面平整。待凝固。表4分离胶12%蒸馏水（mL）分离胶缓冲液（mL）30%Acr-Bis（mL）TEMED（uL）10%APS（uL）取量3.452.54.02070等分离胶完全凝固后，吸出蒸馏水，把按照表5配制好的浓缩胶倒入两板之间，直至凹板约0.5cm处停止，插入梳子，待凝固。表5浓缩胶4%蒸馏水（mL）浓缩胶缓冲液（mL）30%Acr-Bis（mL）TEMED（uL）10%APS（uL）取量6.22.51.332070等浓缩胶完全凝固后，缓慢拔出梳子，把电泳装置放入电泳槽，加入5×电极缓冲液，使液面高出凹板少许。按照测定的蛋白含量确定各个葡萄样本的点样量。点完样，通电电泳。在浓缩胶中以20mA的电流进行电泳，等进入分离胶后，调节电流至45mA，直至颜色样量距离胶板边缘1cm处停止。取下胶板，放入培养皿中，倒入一定量的显色液，在4℃、黑暗条件下放置30min，并不断摇匀，之后在4℃、光照条件下，摇动，直至蛋白条带显出。试剂配制方法：（1）30%Acr-Bis：29.2gAcr+0.8gBis加蒸馏水至100mL棕色瓶4℃保存（2）分离胶缓冲液：18.15gTris加50mL蒸馏水HCl调pH至8.8加蒸馏水至100mL4℃保存（3）浓缩胶缓冲液：6gTris加50mL蒸馏水HCl调pH至6.8加蒸馏水至100mL4℃保存（4）10%APS：过硫酸铵（APS）1g溶于10mL蒸馏水中（5）样品溶解液：浓缩胶缓冲液（1.0mL）甘油（0.8mL）α-巯基乙醇（0.4mL）0.1%（w/v）溴酚兰（0.4mL）蒸馏水（5.4mL）4℃保存（6）电极缓冲液pH8.3：Tris15g+Glycine(甘氨酸)72g加水至1L4℃保存（7）2.45mmol/LNBT母液:0.02003gNBT溶于10ml蒸馏水中避光保存（8）0.3mmol/L核黄素母液：0.0056454g核黄素溶于50mL蒸馏水中避光保存（9）显色液：2.45mmol/LNBT母液（5mL）0.3mmol/L核黄素母液（5mL）TEMED（167uL）EDTA-Na2(0.037224g)加蒸馏水至50mL避光保存苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性测定取2g葡萄叶片，按4:1（mL:g）的比例加入酶提缓冲液，充分研磨后，用四层纱布过滤，然后4℃，8000rpm下离心20min，取上清液即为酶粗提液。取酶粗提液0.5mL，加入0.5mL0.02ML-苯丙氨酸1ml0.1M硼酸缓冲液（pH8.8）和0.5mL蒸馏水（空白对照不加L-苯丙氨酸而是加蒸馏水）。混匀后30℃，水浴1h，加入0.1mL6MHCl终止反应，290nm测OD值。如表6所示表6紫外分光法测定PAL酶活性酶粗提液（mL）0.02ML-苯丙氨酸（mL）0.1MpH8.8硼酸缓冲液（mL）蒸馏水（mL）6MHCl（mL）1（对照）00.5110.12（对照）0.5（灭活）0.510.50.130.50.510.50.140.50.510.50.150.50.510.50.160.50.510.50.1以每小时OD值变化0.01为1个u单位。PAL活性计算公式(U/(mg.h))=（Ack-AE）/(C0.011)式中：Ack-加入灭活酶液的对照组的吸光度Ae—样品管的吸光度C—蛋白含量（mg/mL）0.01--以每小时OD值变化0.01为1个u单位1—反应时间一个小时',)