蛋白质电泳实验,蛋白质电泳实验报告

('蛋白质电泳实验尿素－SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳1．试剂的配制①30%凝胶母液丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺。以温热（利于溶解双丙烯酰胺）的去离子水配制含有29.2%（w/v）丙烯酰胺和0.8%（w/v）N,N’-亚甲双丙烯酰胺的贮存液，丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸，这一脱氨基反应是光催化或碱催化的，故应核实溶液的pH值不超过7.0。这一溶液置棕色瓶中贮存于室温，每隔几个月须重新配制。小心：丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤。②4倍SDS分离胶缓冲液(4×,pH8.8)(200ml)称取SDS0.8g(4%)，Tris36.342g(1.5mol/L)，溶解（必要时加热），用盐酸调pH为8.8，定容至200mL。③4倍SDS浓缩胶（堆积胶或积层胶）缓冲液。(4×，pH6.8)（100ml）称取SDS0.4g(4%)，Tris6.051g(0.5mol/L)，溶解（必要时加热），用盐酸调pH为6.8，定容至100mL。④TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)。TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。⑤10%过硫酸铵。0.5g过硫酸铵溶于5mL去离子水中，可于4℃下存放数月⑥Tris-甘氨酸电极缓冲液（1L）称取3gTris（25mmol/L）,14.4g甘氨酸(192mmol/L),1gSDS（0.1%），溶解后定容至1L，pH应该在8.3左右。也可以制成10×的储存液在室温下长期保存。⑦样品处理液（5×样品缓冲液）（10mL）称取Tris0.07266gTris(60mmol/L),SDS0.02g(2%,W/V),溶于4mL水中,用HCl小心调节pH为6.8,再加5mL50%的甘油(终浓度25%,V/V)，0.5mL2-巯基乙醇(14.4mmol/L)，溴酚蓝0.01g(终浓度0.1%),加去离子水至10mL。可以在4℃下存放数周，或在－20℃下保存数月。⑧考马斯亮蓝R250染色液（1000mL）0.1%考马斯亮蓝R250考马斯亮蓝R-2501.0g（0.1%,W/V）无水乙醇450mL(45%,V/V)冰醋酸100mL(10%,V/V)加水定容至1000mL⑨脱色液（1000mL）无水乙醇100mL(10%,V/V)冰醋酸100mL(10%,V/V)加水定容至1000mL2．尿素－SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制⑴根据厂家说明书安装玻璃板。(琼脂封口)⑵确定所需凝胶溶液体积，按下表给出的数值在一小烧杯中按所需丙烯酰胺浓度配制一定体积的分离胶溶液。(一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并1/21/2蛋白质电泳实验进入下步操作。)配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳15%分离胶溶液（20mL/电泳板,pH8.8)水2.4mL尿素7.2g分离胶缓冲液5mL30%凝胶母液4.mL混匀后,加入10%AP100µL,TEMED10µL,迅速混合。⑶迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液,留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5cm)。再在胶液面上小心注入一层水（约2~3mm高），以阻止氧气进入凝胶溶液⑷分离胶聚合完全后（约30~60分钟），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。⑸制备浓缩胶：按下表给出的数据，在另一小烧杯中制备一定体积及一定浓度的丙烯酰胺溶液。（一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。）配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳5%浓缩胶溶液（10mL/电泳板，pH6.8）水5.75mL浓缩胶缓冲液2.5mL30%凝胶母液1.75mL混匀后,加入10%AP66µL,TEMED10µL,迅速混合。⑹聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶,立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。⑺在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理，在样品中按4:1体积比加入样品处理液，在100℃加热3~4分钟以使蛋白质变性。⑻浓缩胶聚合完全后（30~60分钟），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸电极缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。⑼按预定顺序加样，加样量通常为10～25μL（1.5mm厚的胶）。⑽将电泳装置与电源相接，凝胶上所加恒电流为10mA。当染料前沿进入分离胶后，把电流提高到15mA，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约0.5cm，然后关闭电源。⑾从电泳装置上卸下玻璃板，轻轻撬开玻璃板。紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。3．用考马斯亮蓝对SDS聚丙烯酰胺凝胶进行染色经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品可用考马斯亮蓝R250染色染色1～2小时或过夜。脱色液：脱色需3～10小时，其间更换多次脱色液至背景清楚。此方法检测灵敏度为0.2～1.0\uf020\uf06dg。脱色后，可将凝胶浸于水中，长期封装在塑料袋内而不降低染色强度。为永久性记录，可对凝胶进行拍照，或将凝胶干燥成胶片。2/22/2',)