蛋白质、核酸的酶促降解和含氮化合物代谢

("蛋白质、核酸的酶促降解和含氮化合物代谢学习要点蛋白质是生命物质的基础，是维持生命活动正常进行以及生长发育所必不可少的。泛素系统和溶酶体系统是细胞内蛋白质两个最重要的降解系统。氨基酸经过转氨基与氧化脱氨基和联合脱氨基作用，生成氨和相应的α-酮酸。氨可通过多种途径安全地排出体外；α-酮酸可参入糖酵解、三羧酸循环、糖异生和酮体代谢途径。氨基酸还可以转化成辅酶、激素、生物碱等重要物质。自然界中的不同氮化物相互转化形成氮素循环。固氮生物和工业固氮将N2转变成NH3，NH3被硝化细菌氧化成NO3－，植物吸收NO3－并还原成NH3，通过还原氨基化同化为Glu，再以Glu和Gln为氨基供体合成其它氨基酸和含氮有机物。核酸酶催化核酸水解为核苷酸，可分为核酸内切酶、核酸外切酶和限制性内切酶。核苷酸可进一步降解为戊糖、磷酸和含氮碱。在人体内嘌呤碱的降解产物为尿酸、嘧啶碱彻底降解。生物可利用氨基酸和其它代谢物从头合成核苷酸，还能通过补救途径利用核苷和碱基合成核苷酸。9.1蛋白质的酶促降解9.1.1蛋白水解酶生物体内的蛋白质经常处于不断合成和降解的动态变化之中。生物体内几乎到处都有水解肽键的酶，既包括消化道中消化食物蛋白的蛋白酶，血液中参与血液凝固和溶解血栓的酶以及补体系统，也包括种类繁多、结构和功能更复杂的细胞内蛋白酶。这些酶可按其作用特点分为肽链内切酶和肽链外切酶。肽链内切酶又称蛋白酶，水解肽链内部的肽键，对参与形成肽键的氨基酸残基有一定的专一性，常见的蛋白酶及其作用位点参看表9-1。肽链外切酶包括氨肽酶和羧肽酶，分别降解肽链N端和C端的肽键。如羧肽酶A优先作用于中性氨基酸为羧基端的肽键；羧肽酶B则水解以碱性氨基酸为羧基端的肽键(表9-1)。147表9-1蛋白水解酶作用的专一性酶专一性肽链内切酶胃蛋白酶R4=Trp、PheR3=任何氨基酸残基胰蛋白酶R3=Arg、LysR4=任何氨基酸残基胰凝乳蛋白酶R3=Phe、Tyr、TrpR4=任何氨基酸残基弹性蛋白酶R3=脂肪族氨基酸残基R4=任何氨基酸残基肽链外切酶氨基肽酶R1=任何氨基酸残基R2=除Pro外任何氨基酸残基羧基肽酶AR5=任何氨基酸残基R6=除Arg、Lys、Pro外任何氨基酸残基羧基肽酶BR5=任何氨基酸残基R6=Arg、Lys按其活性部位的结构特征可将蛋白酶分为四类：（1）丝氨酸蛋白酶类活性部位含有Ser残基，受二丙基氟磷酸(DIFP)的强烈抑制。胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶等均属此类。（2）半胱氨酸蛋白酶活性部位含有Cys残基，对于碘乙酸、对-羟基汞苯甲酸等抑制剂十分敏感。植物蛋白酶和组织蛋白酶大多属于此类。（3）天冬氨酸蛋白酶活性中心含有两个Asp残基，最适pH一般为2～4。抑胃肽专一地抑制这类酸性蛋白酶。胃蛋白酶、凝乳酶均属此类。（4）金属蛋白酶含有Zn2+、Mg2+和Ca2+等金属离子，受金属螯合剂如EDTA等的抑制。嗜热菌蛋白酶、信号肽酶以及氨肽酶、羧肽酶等属于这一类。9.1.2食物中蛋白质的消化吸收蛋白质消化的生理意义在于消除食物中蛋白质的种属特异性或抗原性；使大分子蛋白质变为简单的氨基酸，以便吸收和用以合成机体自身特有的蛋白质。蛋白质消化的实质是一系列的酶促水解反应。消化腺一般以酶原形式分泌蛋白酶。酶原进入消化道后被激活。食物蛋白质在多种蛋白水解酶的共同作用下，最终完全水解为氨基酸。蛋白质的消化过程如下：1489.1.3细胞内蛋白质降解像其它细胞组分一样，在生长发育及整个生命周期中蛋白质也在不断地降解和更新。细胞内蛋白质的周转是个十分复杂和受到精密控制的过程，周转速率不仅与生物体的种类营养状况、环境因素、发育阶段等有关，还与蛋白质的种类有关。研究表明，细胞内蛋白质降解对于细胞生长发育和适应内外环境变化具有多种不可或缺的功能。细胞内有两个最重要的蛋白质降解系统即泛素系统和溶酶体系统。9.1.3.1蛋白质降解的泛素途径泛素系统在pH=7.4的胞液和细胞核中起作用，因此又称为碱性系统，主要水解短寿命蛋白和反常蛋白。Hershko，A.等1978年从网织红细胞依赖ATP的蛋白质水解系统中分离出一种热稳定因子，由76个氨基酸组成，后来发现它广泛存在于各类真核细胞，因而命名为泛素(ubiquitin)。在泛素激活酶(E1)、泛素载体蛋白(E2)和泛素-蛋白连接酶(E3)的共同作用下，泛素C-端羧基与底物蛋白中赖氨酸残基ε-氨基形成异肽键，后续泛素以类似方式连接成串(至少4个)，完成对底物蛋白的多泛素化标记（也称为泛素化修饰），形成多泛素化蛋白。在同一组织中存在一种E1、数种E2和多种E3，负责识别不同类型的短寿命蛋白和反常蛋白。此外还有一类泛素C-端水解酶，负责校正错误的泛素化以及把成串的泛素水解成单体以备重复利用。被多泛素化标记的底物蛋白由26S蛋白酶体(proteasome)迅速降解成小的肽片段，再由其它肽酶水解成游离氨基酸。26S蛋白酶体由20S蛋白酶体和19S调节复合物组成，前者包含14个α型亚基和14个β型亚基，构成四个7聚体(α7β7β7α7)叠成的空桶状结构，两端的α7构成了底物进入和产物逸出的通道及19S调节复合物结合部位，中部的β7β7具有多种蛋白酶活性。19S调节复合物至少含有18种蛋白组分，在ATP存在下与20S组成有活性的26S蛋白酶体。图11-1概括了泛肽途径蛋白质降解主要步骤。149图9-1蛋白质降解的泛素途径示意图9.1.3.2溶酶体系统包括多种在酸性pH下活化的小分子量组织蛋白酶，因此又称为酸性系统，主要水解长寿命蛋白质和外来蛋白。9.2氨基酸的分解和转化氨基酸在体内的去路主要有：用于蛋白质和多肽的合成，参与一些其他重要生理活性含氮化合物的合成，或经脱氨、脱羧等反应进一步分解为氨和α-酮酸和胺类等。氨基酸降解产生的α-酮酸即氨基酸的碳骨架在体内可用于合成氨基酸、转变为糖和脂肪或氧化分解为二氧化碳和水。代谢产生的NH3除用于酰胺和其它氨基酸的合成，多余的废NH3则以尿素、铵盐等无毒形式排出体外（图9-2）。植物中分解脱下的NH3则用于合成多胺和许多胺类活性物质，一般很少排出体外。图9-2氨基酸分解与转化图9.2.1氨基酸的脱氨基作用氨基酸脱去氨基生成α-酮酸的过程叫做脱氨基作用。氨基酸的脱氨基作用的方式有氧化脱氨基、转氨脱氨基、联合脱氨基以及非氧化脱氨基和脱酰胺作用等,是氨基酸主要的转化方式。1509.2.1.1氧化脱氨基作用氨基酸在氧化酶或脱氢酶的催化下脱去氨基生成相应酮酸的过程，称作氧化脱氨基作用。脱氢酶中最重要的是谷氨酸脱氢酶，辅酶是NAD+或NADP+，它催化谷氨酸氧化脱氨，生成α-酮戊二酸。谷氨酸脱氢酶广泛存在于动、植及微生物体内，专一性很强，只作用于谷氨酸。氧化酶存在于动物肝、肾和某些细菌、真菌中，以FAD或FMN为辅基，在有氧的条件下，催化氨基酸氧化脱氨生成相应酮酸和H2O2。9.2.1.2转氨基作用转氨基作用是α-氨基酸的氨基在转氨酶催化下转移到α-酮酸的酮基碳原子上，原来的氨基酸生成了相应的α-酮酸，而原来的α-酮酸则形成了相应的氨基酸的过程。转氨酶作用在本质上并没有脱去氨基，但氨基酸之间的相互转换，满足了生物体对不同氨基酸的需求在生物体内除甘氨酸、脯氨酸、赖氨酸和苏氨酸外，其余的α-氨基酸都可以参加转氨基作用。催化转氨基作用的酶叫做转氨酶或氨基转移酶，以磷酸吡哆醛为辅基，不仅参与氨基酸的降解，也用于多数氨基酸的合成。转氨酶在生物体内广泛存在，目前已经发现的转氨酶有50多种，其中以谷丙转氨酶和谷草转氨酶最重要且分布最广，前者催化谷氨酸与丙酮酸之间的转氨基作用，后者催化谷氨酸与草酰乙酸之间的转氨基作用：9.2.1.3联合脱氨基作用联合脱氨基作用是指在转氨酶和谷氨酸脱氢酶的作用下，将转氨基作用和脱氨基作用偶联在一起的脱氨方式。辅因子包括磷酸吡哆醛和NAD+（NADP+）。在自然界中，大多数L-氨基酸氧化酶活力很低，难以满足生物体脱氨的需要，而转氨基作用虽然普遍存在，但151不能最终将氨基脱去。所以动物体内大多数氨基酸都是通过联合脱氨基作用脱去氨基的（图9-3）。图9-3联合脱氨基作用9.2.1.4非氧化脱氨基作用除氧化脱氨基作用以外，还有不同方式的非氧化脱氨基作用：（1）还原脱氨基作用在严格无氧的条件下，某些含有氢化酶的微生物能利用还原脱氨基方式使氨基酸脱去氨基。（2）脱水脱氨基作用L-丝氨酸和L-苏氨酸的脱氨基是利用脱水方式完成的，催化该反应的酶以磷酸吡哆醛为辅酶。（3）由解氨酶催化的脱氨基反应苯丙氨酸解氨酶是这种脱氨基作用的典型例子，它催化苯丙氨酸和酪氨酸发生脱氨。152（4）脱酰胺作用谷氨酰胺和天冬酰胺可在谷氨酰胺酶和天冬酰胺酶的作用下分别发生脱酰胺基作用而形成相应的氨基酸。9.2.2氨基酸的脱羧基作用氨基酸在脱羧酶作用下脱羧,生成胺类化合物的过程称为脱羧基作用。可分为以下两种方式。9.2.2.1直接脱羧基作用氨基酸在氨基酸脱羧酶作用下脱去羧基，生成CO2和胺类化合物，辅酶为磷酸吡哆醛（除组氨酸）。氨基酸脱羧基作用在微生物中普遍存在，在高等动植物组织内不是主要的代谢途径。氨基酸脱羧酶的专一性很高，一般只作用于一种特定的氨基酸。如谷氨酸脱羧酶催化的反应，生成γ-氨基丁酸。γ-氨基丁酸广泛存在于动植物组织中，经一系列反应可转化为琥珀酸进入三羧酸循环。γ-氨基丁酸琥珀酸9.2.2.2羟化脱羧基作用酪氨酸在酪氨酸酶的催化下可发生羟化作用而生成3，4-二羟苯丙氨酸，简称多巴(dopa)，后者可进一步脱羧生成3，4-二羟苯乙胺，简称多巴胺(dopamine)。153多巴进一步氧化后形成聚合物黑素(melanin)。多巴胺可氧化成去甲肾上腺素，甲基化后生成肾上腺素。在植物体内，由多巴和多巴胺可形成生物碱。9.2.3氨基酸降解物的去向及尿素循环氨基酸降解是通过脱氨和脱羧作用生成各种降解产物，如NH3、α-酮酸和胺类等，在生物体内进一步发生代谢转变。9.2.3.1氨的代谢去向氨主要来源于氨基酸分解，也可由胺类分解，游离氨对动植物组织是有害的，故细胞必须不断地将氨转变为无毒（或毒性较小）的化合物。动植物机体内氨的去向主要有以下四种：（1）重新合成氨基酸生物体内的游离氨可与碳水化合物转化成α-酮酸发生氨基化反应，重新生成氨基酸。新生成的氨基酸与原有的氨基酸不尽相同，从数量上也没有增加。（2）生成铵盐有些植物组织中含有大量的有机酸，如异柠檬酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸和草酰乙酸等，氨可以和这些有机酸结合生成铵盐，以保持细胞内正常的pH。（3）生成酰胺在谷氨酰胺合成酶或天冬酰胺合成酶催化下，氨与天冬氨酸和谷氨酸反应生成相应的酰胺，这些酰胺又可以经过谷氨酰胺酶或天冬酰胺酶的作用，将NH3重新释放出来。因此，生成酰胺的形式既是生物体贮藏和运输氨的主要方式，也是解除氨毒的一条主要途径。不同生物由NH3生成的化合物不同，在植物和微生物体内，主要形成天冬酰胺，在动物体内则形成谷氨酰胺。（4）生成尿素——尿素循环在人和哺乳动物体内，氨的主要去路是在肝脏中合成尿素，并随尿排出，约占人体总排氮量的80%以上。在植物中也能形成尿素。尿素合成途径是HansKrebs在1932年发现的第一条环状代谢途径，称为鸟氨酸循环或尿素循环。尿素循环过程主要由4步酶促反应组成，第一步发生在肝细胞的线粒体中，其余三步均在细胞质中进行（图9-4）。其具体反应过程如下。（1）在鸟氨酸转氨甲酰酶作用下，氨甲酰基被转移至鸟氨酸形成瓜氨酸。154（2）瓜氨酸在精氨琥珀酸合成酶作用下，与天冬氨酸结合形成精氨琥珀酸。（3）精氨琥珀酸在精氨琥珀酸裂解酶的作用下，裂解成精氨酸和延胡索酸。（4）在精氨酸酶的作用下，精氨酸水解为尿素和鸟氨酸，尿素进入血液通过肾脏随尿排出，鸟氨酸重新进入线粒体开始新一轮循环。在肝脏中，每经过一次循环需要2个氨基(一个来自游离氨，另一个来自天冬氨酸的氨基)和1分子CO2，并生成1分子尿素。由尿素循环合成一分子尿素需要消耗3个ATP，是一个耗能的过程。图9-4尿素循环①氨甲酰磷酸合成酶；②鸟氨酸转氨甲酰基酶；③精氨琥珀酸合成酶；④精氨琥珀酸裂解酶；⑤精氨酸酶。9.2.3.2α-酮酸的去向氨基酸脱氧生成的α-酮酸可转变成7种中间代谢物：丙酮酸、草酰乙酸、α-酮戊二酸、延胡索酸、琥珀酰-CoA、乙酰CoA和乙酰乙CoA（表9-2）。这些中间代谢物中乙酰乙酰CoA和乙酰CoA可转变成酮体，为其提供碳架的氨基酸称为生酮氨基酸，如亮氨酸、色氨酸、赖氨酸；其余中间产物均可作为糖异生的原料转变成葡萄糖，因而称为生糖氨基酸，如丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸、缬氨酸等；155部分碳架可生酮、另一部分碳架可生糖的称为生糖兼生酮的氨基酸，如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苏氨酸等（图9-5）。表9-2氨基酸降解中产生的中间代谢物氨基酸中间代谢物丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、甘氨酸、苏氨酸丙酮酸蛋氨酸、异亮氨酸、缬氨酸琥珀酰CoA苯丙氨酸、酪氨酸延胡索酸精氨酸、脯氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸α-酮戊二酸天冬酰胺、天冬氨酸草酰乙酸亮氨酸、色氨酸、苏氨酸、异亮氨酸乙酰CoA苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、色氨酸乙酰乙酸(或乙酰乙酰CoA)图9-520种氨基酸的碳骨架降解为7种代谢物之一9.2.4由氨基酸衍生的其他化合物在生物体内，氨基酸不仅用于合成蛋白质，而且还是合成其他含氮化合物（包括核苷酸、脂类、激素、多胺、生氰糖苷、生物碱、卟啉类色素、神经递质、辅酶类、木质素等）的原料。这些含氮化合物在生物体内都起着重要作用（表9-3）。表9-3一些由氨基酸衍生的含氮化合物含氮氨基酸前体含氮衍生物156化合物种类核酸、核苷酸甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸嘌呤、嘧啶类脂甲硫氨酸丝氨酸胆碱鞘氨醇、乙醇胺激素酪氨酸色氨酸甲硫氨酸肾上腺素、甲状腺素吲哚乙酸乙烯多胺精氨酸腐胺、尸胺、精胺、亚精胺生物碱赖氨酸天冬氨酸苯丙氨酸、酪氨酸色氨酸酪氨酸鹰爪豆碱、羽扇豆烷宁烟草生物碱石蒜科生物碱，秋水仙碱吲哚生物碱、毒扁豆碱、麦角碱、马钱子碱、奎宁吗啡，可待因生氰糖苷缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸亚麻苦苷、百脉根苷、苦杏仁苷等卟啉类色素甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸叶绿素、血红素、细胞色素黑色素酪氨酸黑素维生素色氨酸烟酸抗生素缬氨酸、半胱氨酸青霉素神经递质色氨酸5′-羟色胺谷氨酸γ-氨基丁酸蛋氨酸、丝氨酸乙酰胆碱辅酶类色氨酸、甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸NAD+、NADP+157缬氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸泛酸(CoA)谷氨酸参与THFA木质素苯丙氨酸、酪氨酸香豆醇、松柏醇、芥子醇胆汁成分半胱氨酸牛磺酸还原保护谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸谷胱甘肽9.3氨基酸的生物合成9.3.1氮素循环氮素是生物的必需元素之一。在生命活动中起重要作用的化合物，如蛋白质、核酸、酶、某些激素和维生素、叶绿素和血红素等均含有氮元素。在地球表面的氮分布在大气、陆地和海洋中。地球表面的大气组成中氮气约占80%，呈分子态（N2）存在，空气中还含有微量的气态氮化合物，如NO、NO2、NH3等。自然界中的各种氮化物经常处于动态变化中，形成了自然界的氮素循环(nitrogencycle)。在这个循环中，通过生物固氮、工业固氮、大气固氮（如闪电）大气中的氮气转变为氨和硝酸盐，进入土壤中。土壤中的氨在硝化细菌（包括亚硝酸细菌和硝酸细菌）的作用下氧化成为硝酸盐。土壤中的铵盐和硝酸盐被植物吸收后，还原形成氨，再经同化作用把无机氮转化为有机氮，这些有机氮化合物又可随食物或饲料进入动物体内，转变为动物体内的含氮化合物。各种动植物遗体及排泄物中的有机氮经微生物分解作用，形成无机氮，又回到土壤中。土壤中的部分硝酸盐也可经反硝化细菌作用，转变为氮气返回到大气中去。这样，在生物界，总有机氮和无机氮形成了一个平衡（图9-6）。9.3.2生物固氮9.3.2.1生物固氮的意义某些微生物把空气中的分子氮转化为氨态氮的过程称为生物固氮(biologicalnitrogenfixation)。自然界生物固氮每年高达1011kg，约占总固氮量的60%。固氮生物包括两种类型，一类是自生固氮微生物，指独立生活时能使气态氮固定为NH3的少数微生物，如固氮菌、巴氏梭菌、蓝绿藻等；另一类是共生固氮微生物，如与豆科植物共生的根瘤菌、与非豆科植物共生的放线菌等，其专一性强，不同的菌株只能感染一定的植物，形成共生的根瘤。在158根瘤中植物为固氮菌提供碳源，而细菌利用植物提供的能源固氮，为植物提供氮源，形成一个很好的互利共生体系。生物固氮与工业固氮相比，可以大大节约能源，减少环境污染，对维持自然界氮的平衡起着重要作用。土壤中的氨又可被消化细菌氧化生成亚硝酸盐和硝酸盐。固氮生物的研究和利用，对维持和提高土壤肥力具有重大意义。图9-6自然界的氮素循环9.3.2.2固氮酶复合物生物固氮过程由固氮酶复合物完成。固氮酶复合物由两种蛋白组分构成：一个是还原酶，它提供具有高还原势的电子；另一组分是固氮酶，它利用还原酶提供的高能电子把N2还原成NH\uf02b4。还原酶也称铁蛋白，是由两个相同亚基组成的二聚体，相对分子质量为64kDa，含有一个［Fe4S4］簇，每次可传递一个电子。此外，还有2个ATP结合位点。固氮酶也称钼铁蛋白，是由2个α亚基和2个β亚基组成的四聚体（α2β2），相对分子质量为220kDa。其氧化还原中心含有2个钼原子、32个铁原子和相应数目的酸不稳定硫。由还原酶向固氮酶的电子传递与还原酶上的ATP水解相偶联，由N2到NH3的还原过程需6个电子：N2+6e-+6H+——→2NH3实际上，在N2还原过程中还有H2的形成，因此，N2固定过程的实际反应为：N2+8e-+8H+——→NH3+H21598个高能电子来自还原型铁氧还蛋白，还原型铁氧还蛋白的电子来自光合作用的光系统Ⅰ或呼吸电子传递链(图9-7)。生物固氮的总反应为：N2+8e-+16ATP+16H2O+8H+——→2NH3+H2+16ADP+16Pi由反应式可看出，固氮过程消耗的能量非常多，每固定1分子N2共有16个ATP被水解。图9-7在固氮酶系统中N2还原过程的电子传递固氮酶全酶除可以还原N2外，还可以还原多种底物。例如它可以还原N2O：N2O+2H++2e－——→N2+H2ON2O可结合在固氮酶的活性中心，因而对固氮起竞争性抑制作用。固氮酶也能使乙炔（C2H2）还原生成乙烯：C2H2+2H++2e-——→C2H4由于生成的乙烯很容易用气相色谱仪进行含量测定，所以乙烯还原法被广泛用于实验室、田间和植物根际固氮酶活性的测定。9.3.2.3生物固氮的条件生物固氮是一个复杂的生物化学过程，经过研究，人们已经认识到固氮酶催化的反应需要满足三个条件：①需要很强的还原剂，即需要高水平的铁和钼，需要铁氧还蛋白和黄素氧还蛋白的供应。②需要充分的ATP的供应。③需要厌氧环境，固氮酶对氧十分敏感，只有在严格的厌氧条件下才能固氮。这一切构成了固氮过程中生理上的复杂性和局限性。因此，生物固氮不仅是农业微生物的研究课题，也是生物化学的一个重要研究领域。目前国内外正对生物固氮机理和固氮生物化学进行研究，以期早日实现人工模拟生物固氮，为生产合成氨开辟广阔的途径。另外，人们也正努力通过遗传工程技术，使不能固氮的禾本科作物（如小麦、水稻等）也能像豆科作物一样进行固氮，不但可以大量节约氮肥，而且明显提高禾本科作物的产量。9.3.3硝酸还原作用160高等植物不能利用空气中的氮气，仅能吸收化合态的氮。植物可以吸收氨基酸、天冬酰胺和尿素等有机氮化合物，但是植物的氮源主要是无机氮化物，而无机氮化物中以硝酸盐亚硝酸盐及铵盐为主。其中植物最易吸收的是硝态氮。然而，这些硝态氮并不能直接被植物体利用来合成各种氨基酸和其他含氮有机化合物，必须先还原成氨态氮，总反应式如下:NO\uf02d3+9H++8e-——→NH3+3H2O这一还原过程是在硝酸还原酶和亚硝酸还原酶的催化下分步进行的。在植物体内，硝酸盐的还原可在植物的根和叶内进行，但以叶内还原为主。不过在种子萌发的早期，或在缺氧条件下，根部便成为还原硝酸盐主要的部位。9.3.3.1硝酸还原酶硝酸还原酶的作用是把硝酸盐还原成亚硝酸盐。NO\uf02d3+2H++2e-—→NO\uf02d2+H2O硝酸还原酶广泛存在于高等植物、细菌、酵母和藻类中。在植物的绿色组织中该酶的活性较大。根据还原反应中电子供体的不同，可分为两个类型：（1）铁氧还蛋白-硝酸还原酶此酶存在于蓝绿藻、光合细菌和化能合成细菌中。从组囊藻属(Anacystis)分离出的硝酸还原酶是一种含钼的蛋白质，只有一条多肽链，相对分子质量为75kDa，不含黄素蛋白和细胞色素。这类硝酸还原酶以铁氧还蛋白(Fd)作为电子供体。其还原过程如下：NO\uf02d3+2Fd(还原型)+2H+—→NO\uf02d2+Fd(氧化型)+H2O（2）NAD(P)H-硝酸还原酶此类硝酸还原酶存在于真菌、绿藻和高等植物中。按其对电子供体的专一性要求又可区分为对NADH专一的和对NAD(P)H专一的以及可用NADH也可用NADPH的硝酸还原酶。NAD(P)H-硝酸还原酶为寡聚蛋白，所含亚基数因植物而异。它是以FAD、细胞色素b-557和钼为辅因子，这些都参与电子的传递。电子从NAD(P)H到NO\uf02d3的传递过程如图9-8。161图9-8硝酸还原酶的催化机理9.3.3.2亚硝酸还原酶正常情况下在植物细胞内很少积累亚硝酸盐，它很快在亚硝酸还原酶的催化下，进一步还原成氨：NO\uf02d2+7H++6e-——→NH3+2H2O从高等植物和绿藻中分离出的亚硝酸还原酶是一条多肽链，相对分子质量约为60～70kDa，它的辅基是一种铁卟啉的衍生物，分子中还有一个Fe4S4中心，起电子传递作用。亚硝酸还原酶存在于绿色组织的叶绿体中，它的直接电子供体是铁氧还蛋白。光合作用的非环式光合磷酸化，可为亚硝酸还原酶提供还原态的铁氧还蛋白。结合在铁卟啉衍生物辅基上的亚硝酸离子，可直接被还原型铁氧还蛋白还原成氨。此外，在铁氧还蛋白-NADPH还原酶的作用下，也可将氧化态的铁氧还蛋白转变为还原型。亚硝酸被还原成氨的整个过程可表示如图9-9。图9-9叶绿体内亚硝酸还原酶的作用9.3.4氨的同化和各族氨基酸的合成9.3.4.1氨的同化在氮素循环中，生物固氮和硝酸盐还原形成了无机态NH3，必须进一步被同化转变成含氮有机化合物。所有生物基本上都通过谷氨酸脱氢酶或谷氨酰胺合成酶催化形成谷氨酸和谷氨酰胺的方式同化氨。少量的NH3同化为氨甲酰磷酸。（1）谷氨酸合成谷氨酸的合成主要由谷酰胺合成酶和谷氨酸合酶催化。谷氨酰胺合成酶催化谷氨酸和氨反应形成谷氨酰胺，此酶对NH3有高亲和性，完成反应还需ATP水解提供的能量：162形成谷氨酰胺既是氨同化的一种方式，又可消除过高氨浓度带来的毒害，还可作为氨基供体，用于谷氨酸合酶催化的反应：α-酮戊二酸来源于三羧循环中的中间产物，还原剂为NADPH或还原态铁氧还蛋白。可见，在谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶的共同作用下，一分子氨和一分子α-酮戊二酸可净合成一分子谷氨酸。谷氨酸脱氢酶存在于所有生物体内，但由于谷氨酰胺合成酶的Km(NH3)较谷氨酸脱氢酶低得多，生理条件下细胞内的氨浓度水平很低，谷氨酸脱氢酶催化还原氨基化的活性比谷氨酰胺合成酶低很多。因此，生物体内谷氨酸主要是通过谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶这条双酶途径合成的。（2）氨甲酰磷酸的合成同化氨的另一途径是合成氨甲酰磷酸。有二种酶能够催化NH3、CO2、ATP共同作用合成氨甲酰磷酸。氨甲酰激酶催化的反应为：氨甲酰磷酸合成酶催化如下反应：在植物体内，氨甲酰磷酸中的氨基来自谷氨酰胺而不是氨。9.3.5氨基酸的合成163氨基酸的合成需要有氨基和碳架。氨基是通过转氨作用由已有的氨基酸提供的,其中主要是谷氨酸和谷酰胺；碳架则有不同的来源，先形成α-酮酸，再通过转氨作用合成不同的氨基酸。氨基酸的碳架主要是从糖酵解、三羧酸循环和磷酸戊糖途径的中间产物衍生而来的，如丙酮酸、3-磷酸甘油酸、草酰乙酸等（图9-10）。利用这些碳架作为受体分子，把谷氨酸和谷氨酰胺作为主要的氨基供体，在氨基转移酶（转氨酶）的催化下，生成相应的氨基酸在这些相互转化中谷氨酸和谷氨酰胺起着关键性的作用（图9-11）。根据氨基酸合成的碳架来源不同，可将氨基酸分为若干族。在每一族里的几种氨基酸都有共同的碳架来源。在此，不详细讨论每一种氨基酸的合成过程，只概括地介绍它们的碳架来源及合成过程的相互关系。丝氨酸族氨基酸包括丝氨酸、甘氨酸和半胱氨酸。由光呼吸乙醇酸途径形成的乙醛酸经转氨作用可生成甘氨酸，甘氨酸还可缩合为丝氨酸。糖酵解和光合作用的中间产物3-磷酸甘油酸也可用于丝氨酸的合成；丝氨酸可转变成半胱氨酸。164图9-10氨基酸生物合成碳骨架化合物的来源图9-11谷氨酸与其他氨基酸合成的关系天冬氨酸族包括天冬氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和蛋氨酸。它们的共同碳架来源于三羧酸循环中的草酰乙酸，经转氨作用形成天冬氨酸；由天冬氨酸开始可以合成赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和蛋氨酸。丙氨酸族氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸。它们的共同碳架来源是糖酵解生成的丙酮酸。亮氨酸丙酮酸丙氨酸缬氨酸谷氨酸族的氨基酸有谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸和精氨酸。它们的碳架都是来自三羧酸循环的中间产物α-酮戊二酸。合成途径如下：165芳香氨基酸族包括酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。芳香氨基酸的碳架来自磷酸戊糖途径的中间产物4-磷酸赤藓糖和糖酵解的中间产物磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)。合成途径如下：9.4核酸的酶促降解与核苷酸的分解代谢9.4.1核酸降解酶类生物体内存在多种降解核酸的酶类，根据其对核酸的作用位点不同分为核酸外切酶和核酸内切酶（图9-12）。根据对底物的专一性又分为核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶和具有位点专一性的核酸酶，这种核酸酶称限制性内切酶。图9-12核酸外切酶和内切酶9.4.1.1核酸酶核酸酶既可以作用于DNA，也可以作用于RNA。（1）核酸外切酶能够从一端开始水解核酸分子的磷酸二酯键的酶称为核酸外切酶，是非特异性的磷酸二酯酶，有些从DNA或RNA的游离3′-羟基端开始，逐个水解下5′-核苷酸，如蛇毒磷酸二酯酶；有些从游离5′-羟基端开始，逐个水解下3′-核苷酸，如牛脾磷酸二酯酶（图9-13）。166NNNNNNNNNNPPPPPPPPPP牛脾磷酸二酯酶蛇毒磷酸二酯酶5'3'3'5'NNNNNNNNNNPPPPPPPPPPPPPPPPPPPP牛脾磷酸二酯酶蛇毒磷酸二酯酶5'3'3'5'3′图9-13磷酸二酯酶对核酸的水解位置（2）核酸内切酶核酸内切酶特异地水解多核苷酸链内部的磷酸二酯键，具有一定的特异性酯酶。如牛胰核酸酶（RNaseI）作用于嘧啶核苷酸的磷酸二酯键，生成3′-嘧啶核苷酸或以3′-嘧啶核苷酸为末端的寡核苷酸。RnaseI只作用于RNA，对DNA不起作用或活性很低。从曲霉中分离纯化的RNaseT1专一水解鸟苷酸的二酯键，产生3′-鸟苷酸（3′-GMP）或以3′-鸟苷酸为末端的寡核苷酸（图9-14）。图9-14核酸内切酶对RNA专一性水解图9.4.1.2脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶专一水解DNA，作为内切酶，可以切断双链，或切断单链；作为外切酶，具有5′→3′或是3′→5′的切割能力。例如牛胰脱氧核糖核酸酶(DNaseⅠ)，可切割双链和单链DNA，产物为5′-磷酸为末端的寡核苷酸，而牛脾脱氧核糖核酶(DNaseⅡ)降解DNA产生3′-磷酸为末端的寡核苷酸。尚未发现碱基专一性的DNase，但是有序列专一性的限制性内切酶。9.4.1.3限制性内切酶限制性内切酶也称限制性酶或限制酶，是1979年由W.Arber,H.Smith和D.Nathans等人在细菌中发现的。限制性内切酶具有极高的专一性，能识别双链DNA上特定的位点，将两条链都切断，形成粘末端或平末端。限制性内切酶是分析染色体结构、制作DNA的限制酶谱、测定较长的DNA序列、基因的分离和体外重组等研究中不可缺少的工具，在分子生物学研究中具有非常重要的作用。细菌除具有限制酶外，还具有一种对自身DNA起修饰作用的甲基化酶。一种限制酶和其相应的修饰酶对底物DNA的识别和作用的部位是相同的。修饰酶使该部位上的碱基甲基化，从而使限制酶对这种修饰过的DNA不再起作用。在细胞中，限制酶的生物学功能在于167PyPuPyPyPuGUCGAPPPPPPPPPPRNaseΙRNaseT1RNaseΙRNaseT1PyPuPyPyPuGUCGAPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPRNaseΙRNaseT1RNaseΙRNaseT1核苷酸酶H2OPi降解外源侵入的DNA，保护的自身DNA。限制性内切酶有三种类型。大多数Ⅱ型限制性内切酶可以识别DNA上的特定位点。这些位点的长度一般4～8bp，通常具有回文结构。它们通常以三种方式切开DNA双链，分别产生平端及5′或3′-突出的粘性末端（图9-15）。图9-15三种不同类型限制性内切酶的切割类型目前常用的限制酶约100多种，主要根据它们的来源菌种命名。以EcoRI为例，第一个大写字母E为大肠杆菌的属名(Escherichia)的第一个字母；第二、三两个小写字母co为它的种名(coli)的前两个字母；第四个字母大写R表示所用大肠杆菌的菌株；最后一个罗马数字表示从该细菌中分离出来的这一类酶的编号。9.4.2核苷酸分解代谢9.4.2.1核苷酸降解生物体内广泛存在的核苷酸酶（磷酸单酯酶）可催化核苷酸水解生成磷酸和核苷。核苷可在核苷酶的作用下进一步分解为戊糖和碱基。按催化反应的不同可分为核苷磷酸化酶和核苷水解酶。核苷磷酸化酶广泛存在于生命体内，催化反应可逆，对两种核苷都起作用主要催化核苷分解生成含氮碱基和磷酸戊糖；核苷水解酶主要存在于植物、微生物体内，只作用于核糖核苷，催化反应不可逆，主要是将核苷分解生成含氮碱和戊糖。核苷酸168细菌属菌名菌株酶编号EcoRІ细菌属菌名菌株酶编号EcoRІEcoRІ核苷磷酸化酶核苷＋磷酸碱基＋戊糖－1－磷酸核苷＋H20核苷水解酶碱基＋戊糖9.4.2.2嘌呤的降解不同种类生物降解嘌呤碱基的能力不同，因而代谢产物的形式也各不相同。人类、灵长类、鸟类、爬虫类以及大多数昆虫中嘌呤的最终产物为尿酸；人类及灵长类以外的哺乳动物、腹足类体内存在尿酸氧化酶，可将尿酸氧化为尿囊素，因此，尿囊素是其嘌呤代谢的终产物；某些硬骨鱼中则尿囊素再被尿囊素酶继续分解为尿囊酸；在大多数鱼类、两栖类中的尿囊酸酶，可将尿囊酸进一步分解为尿素和乙醛酸；而氨和二氧化碳则是海洋无脊椎动物星虫类、甲壳类体内尿素代谢的终产物。在植物、微生物体内也发现了类似的嘌呤代谢途径（图9-16）。图9-16嘌呤碱的分解代谢过程9.4.2.3嘧啶的降解嘧啶碱在生物体内可被彻底降解；胞嘧啶和尿嘧啶可生成NH3、CO2和β-丙氨酸；胸嘧啶可生成NH3、CO2和β-氨基异丁酸；这两种β-氨基酸经脱氨、氧化，分别生成丙二酸单酰CoA和甲基丙二酸单酰CoA，汇入碳代谢途径（图9-17）。169图9-17嘧啶的分解代谢9.5核苷酸的合成9.5.1核糖核苷酸的合成动、植物和微生物生物体内的核苷酸合成有两条途径。一是利用氨基酸、磷酸戊糖等简单的化合物为原料，经一系列酶促反应从头合成核苷酸的过程，称为从头合成途径。该途径不经过碱基、核苷的中间阶段，是核苷酸生物合成的主要途径。另一条是直接利用细胞中自由存在的碱基（嘌呤和嘧啶）和磷酸戊糖合成核苷酸的过程，称为救补途径。补救途径所需要的碱基和磷酸戊糖主要来源于细胞内核酸的分解，细菌生长的介质或动物消化管食物分解产生的核苷和碱基，进入细胞后也可以用于补救途径。不同的组织中，两条途径的重要性不同，植物、肝细胞及多数细胞以从头合成为主，而脑组织和骨髓则以补救途径合成为主。9.5.1.1嘌呤核苷酸的从头合成几乎所有的生物体都能合成嘌呤碱。由乳鸽的营养试验和同位素示踪实验证明，嘌呤环中的各原子来源于不同的物质，嘌呤环上第一位的N来自天冬氨酸的氨基氮，第3位和第9位的N来自谷氨酰胺的酰胺氮，第2位和第8位的C来自甲酸盐，第6位的C来自二氧化碳，第4位、第5位的碳和第7位的氮来自甘氨酸(图9-18)。170图9-18嘌呤环各原子的来源嘌呤核苷酸的合成以5-磷酸核糖为起始物，经历11步反应，先形成次黄嘌呤核苷酸(IMP)，再由IMP生成AMP和GMP。反应历程以涉及的酶参看图9-19和图9-20。图9-19次黄嘌呤核苷酸(IMP)的合成171天冬氨酸谷氨酰胺二氧化碳甲酸盐甲酸盐甘氨酸图9-20AMP和GMP的合成9.5.1.2嘧啶核苷酸的从头合成同位素标记实验证明：嘧啶环上的N-3和C-2分别来自于氨甲酰磷酸的NH3和CO2，其余四个原子来源于天冬氨酸(图9-21)。图9-21嘧啶环各原子的来源嘧啶核苷酸与嘌呤核苷酸的合成有所不同。先利用小分子化合物形成嘧啶环，再与磷酸核糖结合形成嘧啶核苷酸。而且都是先合成尿苷酸，再转变成其他嘧啶核苷酸（图9-22172氨甲酰磷酸和图9-23）。图9-22尿嘧啶核苷酸的生物合成过程1.氨甲酰磷酸合成酶；2.天冬氨酸氨甲酰转移酶；3.二氢乳清酸酶；4.二氢乳清酸脱氢酶；5.乳清酸磷酸核糖转移酶；6.乳清酸核苷5′-磷酸脱羧酶图9-23由尿苷酸转变为胞嘧啶核苷酸9.5.1.3胸腺嘧啶核苷酸的合成在DNA中存在的胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTMP)，由dUMP在dTMP合成酶的催化下173甲基化生成。反应需要叶酸衍生物作为一碳单位的供体和还原剂(图9-24)。图9-24胸腺嘧啶的生物合成dR=脱氧核糖，FH2=二氢叶酸，FH4=四氢叶酸9.5.1.4核苷酸合成的补救途径在生物体内存在许多催化游离碱基和核苷合成单核苷酸的酶，可以直接利用核酸降解产物或外源补充的碱基或核苷形成核苷酸。有两种方式：一种方式是在磷酸核糖转移酶催化下，碱基和5-磷酸核糖焦磷酸（PRPP）反应直接生成相应的核苷酸：腺嘌呤+PRPPAMP+PPi次黄嘌呤（鸟嘌呤）+PRPPIMP（GMP）+PPi另一种方式是在尿苷-胞苷激酶的作用下，催化尿苷或胞苷生成相应的核苷酸：补救途径一方面利用游离的碱基或核苷合成核苷酸，节省了ATP和其它代谢物的消耗，同时避免了这些碱基降解产物过多给细胞带来的负担。9.5.1.5核苷二磷酸、核苷三磷酸的合成在生物体内，核苷酸多以核苷二磷酸、核苷三磷酸的形式参与反应。这些(d)NDP和174尿嘧啶+PRPPUMP+PPi尿嘧啶磷酸核糖转移酶尿苷（胞苷）+NTPUMP（CMP）+PPi尿苷-胞苷激酶腺嘌呤磷酸核糖转移酶次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(d)NTP是在(d)NMP水平上，由ATP提供磷酸根，由相应的激酶所催化合成的。如腺苷酸激酶，鸟苷酸激酶、嘧啶核苷酸激酶所催化的核苷二磷酸生成的反应：9.5.2脱氧核苷酸的合成脱氧核糖核苷酸都是由核糖核苷酸还原而成，对大多数生物而言，是在二磷酸核糖核苷酸的水平上进行的。参与该还原过程的酶和蛋白质有核糖核苷酸还原酶、硫氧还蛋白还原酶、硫氧还蛋白等，其过程见图9-25。dTMP的合成过程见图9-24。图9-25脱氧核糖核苷酸的形成思考题1.氨基酸脱氨基有哪些途径？各有何特点？2.简述尿素循环的主要过程和生理意义。3.生物固氮有何意义？4.简述谷氨酸在各族氨基酸的合成中的意义。5.什么是限制性内切酶？有何特点？它的发现有何特殊意义？6.简述嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸合成的区别。175（d）AMP+（d）ATP（d）ADP+（d）ADPAMP激酶（d）GMP+（d）ATP（d）GDP+（d）ADPGMP激酶（d）CMP+（d）ATP（d）CDP+（d）ADP嘧啶核苷酸激酶（d）UMP+（d）ATP（d）UDP+（d）ADP嘧啶核苷酸激酶176",)