聚丙烯酰胺凝胶电泳实验,聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告

('聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）一、目的要求（1）学习电泳原理和技术（2）学习和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分离蛋白质技术二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）通过化学催化剂（过硫酸铵），四甲基乙二胺（TEMED）作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。血清蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳一般可分成12～25个组分。因此适用于不同相对分子质量物质的分离，且分离效果好。聚丙烯酰胺凝胶作为电泳材料的特性人工合成聚丙烯酰胺凝胶的化学体系的组成及功能：Acr：丙烯酰胺Bis：甲叉双丙烯酰胺AP：过硫酸铵——化学催化剂TEMED：四甲基乙二胺——加速剂SDS是一种阴离子去垢剂，SO32-带负电荷。在含有强还原剂的SDS溶液中可形成SDS-蛋白质复合物。由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用。三、实验材料（一）试剂1、30%丙烯酰胺混合液（Acr:Bis为29:1）称取丙烯酰胺（Acr）29g及甲叉丙烯酰胺（Bis）1.0g，用去离子水溶解并稀释至100ml，贮棕色瓶中于4℃保存，可用一个月。2、1.5mol/LpH8.8Tris-HCl缓冲液取1mol/LHCL溶液48ml、三羟甲基甲烷（Tris）36.6g，加双蒸馏水至80ml使其溶解，调pH至8.8，然后用双蒸馏水稀释至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。3、1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液取1mol/LHCL溶液48ml，Tris5.98g，加双蒸馏水至80ml，调pH6.8，用双蒸馏水稀释至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。4、Tris-甘氨酸电泳缓冲液称取Tris6g、甘氨酸28.8g，加蒸馏水850ml，调pH至8.3，加蒸馏水到1000ml，4℃贮存。用时可做10倍稀释。5、10%过硫酸铵（AP）6、10%SDS（十二烷基磺酸钠）称取SDS10g，加蒸馏水100ml使其溶解。7、四甲基乙二胺（TEMED）8、上样缓冲液取1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液6.25ml，蔗糖10g，SDS2.3g，1g/L溴酚蓝10ml，加蒸馏水溶解，混合至100ml。9、考马斯亮蓝染色试剂考马斯亮蓝R250染色液：浓度为2.5g/L，用甲醇∶醋酸∶蒸馏水=5∶1∶5的溶液配制（V/V）。10、脱色液：取冰醋酸7.5ml、甲醇5ml，加蒸馏水至100ml。11、样品：人血清。12、蛋白质分子量标志物市售中分子量蛋白质分子量标志物。也可选择5种以上的已知分子量蛋白质自行配制，注意其分子量分布要能满足需要，各种蛋白质的浓度基本相等。（二）仪器圆盘电泳槽（或垂直板电泳槽）、稳压稳流电泳仪、脱色摇床。四、实验方法（一）准备圆盘电泳槽、电泳仪。（二）凝胶制备按下表分别配制分离胶和浓缩胶（此量可供2人用）分离胶(12%5ml)浓缩胶(5%2ml)ddH2O1.6ml1.4ml30%混合液2.0ml0.33ml1.5mol/LpH8.8Tris-HCl1.3ml1.0mol/LpH6.8Tris-HCl0.25ml10%SDS50μl20μl10%Ap50μl20μlTEMED4μl4μl注意：边配边平摇烧杯混匀，配好胶后迅速用滴管灌胶（三）灌胶1、先将胶管（5х90mm）封好底，将配制好的分离胶液灌注入胶管内，约70mm高度（掌握分离胶的高度），在凝胶表面轻轻加一层正丁醇液（约3～4mm）。用于隔绝空气，使胶面平整。室温下静置约30～60min。观察胶和正丁醇之间的界面，判断胶是否凝固。要在确认分离胶彻底凝固后才开始配制浓缩胶。2、分离胶凝固好后，倒掉覆盖在分离胶表面的正丁醇，并用去离子水冲洗一次，倒置吸净残留的水。将配制好的浓缩胶液灌注入胶管内（约15mm），在凝胶表面轻轻加一层正丁醇液（约3～4mm），用于隔绝空气，使胶面平整。室温下静置约30～60min。观察胶和正丁醇之间的界面，判断胶是否凝固。胶凝固好后，倒掉覆盖在胶表面的正丁醇，并用去离子水冲洗一次，倒置吸净残留的水，准备加样。（四）样品预处理和加样1、取血清0.1ml、上样缓冲液0.9ml，混匀，在沸水中煮沸5min。2、将胶管封底去掉，放入圆盘电泳槽中，套紧，不能有空的孔，将Tris-甘氨酸电泳缓冲液加入圆盘电泳上、下槽中，电泳缓冲液要盖过胶管口，然后用微量加样器（或注射器）将样品10μl加到胶管胶面内。（五）电泳上槽接负极，下槽接正极，先调电压为120v/浓缩胶，开始电泳，当指示染料进入分离胶后，将电压增加到80v/分离胶胶，继续电泳直至染料抵达距分离胶下端约1cm处，停止电泳，断开电源。电泳时间约1.0~1.5h。（六）考马斯亮蓝染色电泳结束后，取出电泳胶管，用长注射器针剥胶，一边注水一边推胶，直至胶出。将胶移至大培养皿中，精确量取并记录凝胶长度和指示染料的迁移距离（分离胶上缘到染料条带中心距离），然后将凝胶板浸入考马斯亮蓝染色液中0.5-1h，再用脱色液脱色1~2天，至背景无色为止。区带可作定性或定量分析。（七）校正曲线的数据处理和分子量测定精确量取并记录染色后凝胶长度、各标志蛋白质和各待测蛋白质区带的迁移距离（分离胶上缘到各蛋白质区带中心）。按下式计算各蛋白质的相对迁移率（Rm值）。在半对数纸上，以各标志蛋白质的Rm值为横坐标（普通尺度），相应的分子量为纵坐标（对数尺刻度）作图，即得分子量校正曲线。根据各待测蛋白质的Rm值，查此校正曲线，可求各待测蛋白质的相对分子量。五、注意事项1．制胶过程中用正丁醇封住胶面是为了阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。2．本法也适合于其他生物样品中蛋白质的分析。上样量不宜过大，否则会出现过载现象。尤其是考马斯亮蓝R250染色，在蛋白质浓度过高时，染料与蛋白质的氨基(－NH)形成的静电键不稳定，其结合不符合Beer定律，使蛋白质量不准确。3．Acr和Bis有神经毒性，可经皮肤、呼吸道等吸收，故操作时要注意保护。附表1分子量范围与凝胶浓度的关系蛋白质核酸(RNA)分子量范围适用的凝胶浓度/(%)分子量范围适用的凝胶浓度/(%)<10420-30<10415–20(1-4)×10415-20104–1055-10(1-5)×104-1×10510-15105-2×1062-2.61×1055-10>5×1052-5不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理本实验采用不连续的聚丙烯酸胺凝胶电泳分离小麦苗过氧化物酶同工酶。系统的不连续性表现在以下几个方面：（1）凝胶层的布连续性：凝胶由上、下两层胶组成，两层凝胶的孔径不同。上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。（2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH的布连续性：本实验采用碱性系统，电极缓冲液为pH8.9的Tris一HCl缓冲液，浓缩胶和分离胶缓冲液均为Tris一HCl缓冲液，但pH值分别为6.7和8.9。（3）电位梯度的不连续性：由于pH的不连续性，在电场中形成了不连续的电位梯度。（详见后述）在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。在这三种效应的共同作用下，待分离的物质很好地分开。下面以本实验要分离的小麦过氧化物酶同工酶为例，分别说明这三种效应的作用：（1）电荷效应：各种酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定电极，以一定速度泳动。（2）分子筛效应：分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到阻力较小，移动较快，反之，分子量大，形状不规则的分子，电泳过程中受到的阻力较大，移动较慢。（3）浓缩效应：待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。其原因如下。①由于两层凝胶孔径不同，酶蛋白向下移动到两层凝胶界面时，阻力突然加大，速度变慢。这样，就在两层凝胶交界处使待分离的酶蛋白区带变窄，浓度升高。②在聚丙烯酰胺凝胶板中，虽然浓缩胶和分离胶用的都是Tris-HCl缓冲液，但上层浓缩胶的pH为6.7，下层分离胶的pH为8.9。HCl是强电解质，不管在哪层胶中，HCl几乎都全部电离，Cl-布满整个胶板。待分离的酶蛋白样品加在顶层，浸在pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液中。电泳一开始，有效泳动率最大的Cl-迅速跑到最前边，成为快离子（前导离子）。在pH6.7条件下解离度仅有0.1-1.0%的甘氨酸有效泳动率最低，跑在最后边，成为慢离子（尾随离子）。这样，快离子和慢离子之间就形成了一个不断移动的界面。在pH6.7条件下带有负电荷的酶蛋白，其有效泳动率介于快慢离子之间，被夹持分布于界面附近，逐渐形成一个区带。由于快离子快速向前移动，在其原来停留的那部分地区成了低离子浓度区，即低电导区。因为电位梯度V、电流强度1和电导率S之间有如下关系：V＝I/S所以在电流恒定条件下低电导区两侧就产生了较高的电位梯度。这种在电泳开始后产生的高电位梯度作用于酶蛋白和甘氨酸慢离子加速前进，追赶快离子。本来夹在快慢离子之间的酶蛋白区带，在这个追赶中被逐渐地压缩聚集成一条更为狭窄的区带。这就是所谓的浓缩效应。在此区带中，各种酶蛋白又按其电荷而分成不同层次，在进入分离胶前被逐步分离，形成若干条离得很近但又不同的“起跑线”。后来，当酶蛋白和慢离子都进入分离胶后，pH从6.7变为8.9，甘氨酸解离度剧增，有效迁移率迅速加大到超过所有酶蛋白分子，从而赶上并超过所有酶蛋白分子。此时，快慢离子的界面跑到被分离的酶蛋白之前，不连续的高电位梯度不再存在。于是，此后的电泳过程中，酶蛋白在一个均一的电位梯度和pH条件下，仅按电荷效应和分子筛效应而被分离。与连续系统相比，不连续系统的分辨率大大提高，因此已成为目前广泛使用的分离分析手段。',)