PCR实验室建设的规范及要求,pcr实验室设计标准及规范

010203040506PCR实验室建设PCR实验室文件体系标准PCR实验室建设国家法规PCR实验概述PCR实验室运行体系PCR实验概述PCR实验概述——实验目的PCR实验是专门用来检验艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一种检测手段。1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的PCR技术。PCR实验概述——基本原理PCR(PolymeraseChainReaction)即聚合酶链式反应，又称无细胞分子克隆系统或体外酶促基因扩增法。是基因扩增技术的一次重大革新，它可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍。PCR是在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。。PCR实验概述——基本原理一对合成DNA的引物经过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍。国家法规国家法规PCR实验室建设依据：卫生部颁发的《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》（卫医发[2002]10号）分子诊断实验室应按照《医疗机构临床基因扩增实验室管理办法》（卫医发【2010】194号）要求进行建设。分子生物实验室按照检测技术平台、检验项目和检验标本量合理分区，一般常规的分子生物实验室分为四个区，分别为试剂贮存和准备区、标本制备区、基因扩增区、扩增产物分析区。PCR实验室建设要求试剂准备区：该实验区主要进行的操作为贮存试剂的制备、试剂的分装和反应混合液的制备。试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的试剂。对于气流压力的控制，本区并没有严格的要求。标本制备区：该区域主要进行的操作为临床标本的保存、核酸（RNA、DNA）提取、贮存及其加入至扩增反应管。本区的压力梯度要求为：相对于试剂准备区为负压，以避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。基因扩增区：该区域主要进行的操作为DNA和cDNA扩增。本区的压力梯度要求为：相对于标本制备区为负压，以避免气溶胶从本区漏出。PCR实验室建设要求——分区PCR实验室建设要求——总结分子实验室分区依据：1.技术平台；2.检验项目；3.工作量分子实验建设基本要求：1.为避免交叉污染，分子生物实验室各区域在物理空间上必须是完全相对独立的，不能有连通的中央空调，各区域无论是在空闲还是在使用中，应始终处于完全的分隔状态，不能有空气的直接流通，进入各个工作区域必须严格遵循单一方向进行，空气按试剂准备区→标本制备区→扩增（及产物分析区）方向流动。2.实验室到底要分多少个区，每个区域需要多大的面积，与实验室采用的检测平台及检测项目的多与少，工作量的大与少有关系，自动化设备有助于在一定程度上减少区域。如果做Sanger测序需要5或6个区（测序前的扩增产物电泳与纯化不要放在同一区域内）。如果实验室既做病原体核酸检测，又做遗传病基因检测，还做染色体非整倍体无创产前高通量测序，为了避免工作相互干扰及高浓度组织样本核酸提取对低浓度游离DNA样本的交叉污染，可能需要设置多个标本制备区。3.各个实验区域设置合理，各个实验区域要有明显的标记（如醒目的门牌或不同的地面颜色等），以避免各个不同实验区域设备物品、试剂等发生混淆。各区的可移动的仪器设备及各种物品包括实验记录、记号笔、试管架及清洁用具等必须专用。4.应在标本制备区、基因扩增区及产物分析区等相对有可能出现“污染物”的区域安装排风扇或其他排风和有效的通风设施，控制可能会存在污染实验区域内的空气流出至实验室外，同时控制外部可能污染的空气进入相应的实验区域内，如有实验室通风系统，则通风换气建议大于10次/小时。5.采用100%外排的B2级生物安全柜。标本制备区有生物安全柜，建设实验室时一定要充分考虑实验室内进风的量和速度，所要安装的分体空调和进风口要避免干扰生物安全柜的使用。6.防止实验室交叉污染，提供一个物理上的阻隔基础，达到防止交叉污染的目的，光有规范分区并不充分，实验室日常工作的严格管理和工作人员对规程的遵守，是核心之所在。7.各区物品以传递窗传递，要有合格有传递窗，要求两边门连锁装置，内有紫外线照射装置。PCR实验室建设—平面布局形式各实验用房彼此相距较远，呈分散布置形式。各实验之间不易相互干扰。除各实验室自身做好防护，防止外界环境对实验造成影响外，其它无特殊条件要求。分散式01完成PCR四个实验过程的实验用房相邻布置，形成集中、独立的实验区域。每个实验室应设置独立缓冲间、实验室间应设置带消毒装置的传递窗。组合式02临床PCR实验室设计的一般原则：”十六字口诀“各区独立、注意风向、因地制宜、方便工作临床PCR实验室设计的一般原则：“十六字口诀”各区独立(1)各区在物理空间上完全隔离(2)不能使用连通各区的中央空调(3)需要安装分体式空调(4)不能各区装修隔断不密封(5)不能使用上吊推拉门或平开门(6)不能门下面留门缝，(7)使用合格的传递窗双开门密闭严实(8)杜绝空气相通分子生物实验室污染的主要一个来源就是扩增产物气溶胶产生，设计实验室时通过控制空气流向来防止PCR下游扩增产物随空气逆流进入上游PCR操作“洁净”区域，各区设置缓冲间，缓冲间主要作用是为了维持空气流向防止污染。注意风向因地制宜实验室建设具体情况具体分析，实验室各区既可是相互邻近，也可以分散在同楼层的不同处，甚至不同的楼层。前提是实验室设计尽可能合理和规范，便于管理。(1)考虑实验室人员在日常工作中的合理活动和大型仪器设备的进出(2)便于工作服和工作鞋的换穿(3)工作区域进入方便，避免无法重复进入(4)利于实验室管理方便工作临床PCR实验室设计的一般原则：“十六字口诀”标准PCR实验室建设标准PCR实验室建设标准PCR实验室建设的原则：工作有序、互不干扰、防止污染、报告及时标准的PCR实验区包括：试剂准备区、标本制备区、扩增区、产物分析区、各区配套的缓冲区及公共走廊。建设依据：《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》卫办医政发【2010】194号《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》《生物安全实验室建筑技术规范》GB50346-2011《实验室生物安全通用要求》GB19489-2008《洁净厂房设计规范》GB50073—2013《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》WS233-2002中华人民共和国卫生部整个区域有一个公用走廊，每个独立实验区设置有专门的缓冲区。通过压差控制，使整个PCR实验过程中试剂和标本免受气溶胶的污染，并且降低扩增产物对人员和环境的污染。标准PCR实验室建设——平面布局形式标准PCR实验室建设——设计要点主体结构标准四区分隔和气压调节消毒机械连锁不锈钢传递窗地面照明123456目前实验室的主体多为彩钢板、铝合金型材。室内所有阴角、阳角均采用铝合金R50内圆角铝，从而解决容易污染、积尘、不易清扫等问题。并且彩钢板结构牢固，线条简明，美观大方，密封性好。将PCR过程分成试剂准备、标本制备和PCR扩增区及产物分析检测区四个独立的实验区。整个区域有一个整体缓冲走廊。每个独立实验区设置有缓冲区，同时各区通过气压调节，使整个PCR实验过程中试剂和标本免受气溶胶的污染并降低扩增产物对人员和环境的污染。在四个实验区和四个缓冲区顶部以及传送窗内部安装有紫外灯，供消毒用。在试剂准备区和标本制备区还设置移动紫外线灯，对实验桌进行局部消毒。试剂和标本通过机械连锁不锈钢（不建议使用电子连锁方式）传递窗传递，保证试剂和标本在传递过程中不受污染（人物分流）。地面建议使用PVC卷材地面或自流坪地面，整体性好。便于进行清扫，耐腐蚀。没有条件的也可采用水磨石地面，或大块的瓷砖（至少800mm×800mm）接缝需要小于2mm。灯具要选用净化灯具，能达到便于清洗、不积尘的特点。标准PCR实验室建设——空气流和压差要求1.PCR实验室的空气流向必须严格按照试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区空气压力逐渐递减方式进行，防止扩增产物顺空气气流进入扩增前的区域。通过控制进风风量与排风风量达到压力效果2.空气洁净级别不同的相邻房间之间的静压差应大于5帕，洁净室(区)与室外大气的静压差应大于10帕，应配备监测静压差的设备，并定期监控。一般情况下，试剂配制室及样品处理室宜呈微正压，以防外界含核酸气溶胶的空气进入造成污染；核酸扩增室及产物分析室应呈微负压，以防含核酸的气溶胶扩散出去污染试剂与样品；PCR实验室缓冲间内，可设置正压，使室内空气不流向室外，室外空气不流向室内。标准PCR实验室建设——空气流和压差要求在实际的使用调试过程中我们会遇到缓冲的气压很难调到设定值，如扩增和产物缓冲区的-5～-10Pa，在调试过程中会出现压差不平衡问题，比如洁净走廊往缓冲方向流入缓冲就是小负压室，缓冲再被动流入负压内室就应变为正压，从而导致缓冲间排风大于送风量，也就是送风设置为关闭状态后基本可以实现负压的设定值，因此关闭送风维持负压状态是不可行的。参考案例第二层隔离屏障第一层隔离屏障缓冲间设置为相对或绝对的正压值是很有必要也符合使用标准的标准PCR实验室建设——实验室面积一般来说各房间的面积没有严格要求，只需能放置所需仪器设备，并且便于人员操作即可，但是有生物安全柜的房间面积不能小于10平米，并且每增加一台生物安全柜，房间就要增加10平米。标准PCR实验室建设——洁净装修要求1.洁净室（区）的内表面应平整光滑、无裂缝、接口严密、无颗粒物脱落，并能耐受清洗和消毒，墙壁与地面的交界处宜成弧形或采取其他措施，以减少灰尘积聚和便于清洁。2.洁净室(区)内各种管道、灯具、风口以及其他公用设施，在设计和安装时应考虑使用中避免出现不易清洁的部位。3.洁净室(区)的窗户、天棚及进入室内的管道、风口、灯具与墙壁或天棚的连接部位均应密封。1.进入各个区域必须严格按照单一方向进行，不同的工作区域使用不同的工作服（例如不同的颜色）。工作人员离开时，不得将工作服带出。2.各工作区域内配置专用的工作服和工作鞋，工作服要求不同颜色，工作鞋要求包裹整个脚面，并且在工作服和工作鞋上标记工作区域名称。标准PCR实验室建设——工作服要求标准PCR实验室建设——人流路径与物流路径进入实验室区域工作人员应该按照以下路径：公共清洁区——更衣间（更换洁净服）——缓冲间——污染实验区工作人员退出实验室的路径为：污染试验区——缓冲间——淋浴间（有条件的可设置）——更衣间——公共清洁区所有的物品进入实验区必须经过传递窗，利用传递窗消毒后才可进入，实验室内所有物品的也必须经过传递窗才可以传递到其他实验区。一般实验室门主要向里开，但如有危险的房间，房门应朝外开；有压差梯度的房间，门的开启方向应朝向正压方向一侧开启；考虑到消防安全，对于那些主要逃生门的开启方向应朝向清洁区方向开启。标准PCR实验室建设——门的开启方向标准PCR实验室建设——基本仪器设备考虑试剂准备区标本制备区扩增区扩增产物分析区本区所使用的仪器设备可能有加样器、电泳仪（槽）、电转印仪、杂交炉或杂交箱、水浴箱、DNA测序仪、酶标仪和洗板机等。扩增区主要仪器就是核酸扩增热循环仪（PCR仪，实时荧光或普通的）。热循环仪的电源应专用，并配备一个稳压电源或UPS，以防止由于电压的波动对扩增测定的影响。此外，根据工作需要，还可配备加样器、超净台等。标本制备区仪器设备主要应有生物安全柜（B2级），此外还应配备加样器、台式高速离心机（冷冻及常温）、台式低速离心机、恒温设备（水浴和/或干浴仪）、冰箱、混匀器和可移动紫外灯等。试剂准备区仪器设备主要应有加样器、冰箱、天平、低速离心机、混匀器、可移动紫外灯等。可使用超净工作台作为试剂配制操作台面。实时荧光PCR技术平台标准PCR实验室建设——总结1.PCR实验室室内设计参数区域洁净度等级最小换气次数（次/小时）与室外方向上相邻相通房间最小压差(Pa)温度（℃）相对湿度（%）风速（m/s）噪声dB（A）试剂储存和准备区8121018~2640~60≤0.15<60标本制备区815818~2640~60≤0.15<60扩增反应混合物配制和扩增区815-1018~2640~60≤0.15<60扩增产物分析区815-1518~2640~60≤0.15<60缓冲间-6018~2740~60--<60PCR专用走廊-6518~2740~60--<602.PCR实验室要严格贯彻既有安全工作制度或安全标准操作程序，所有操作应符合国家相关规范要求。3.建筑布局上对PCR实验室进行合理分区。4.严格控制各实验室房间的压力梯度，防止扩增产物污染样本。5.设置净化空调系统和杀菌消毒装置，减少室内现存污染物对实验的影响。PCR实验室文件体系PCR实验室文件体系123PCR实验室运行体系PCR实验室运行体系按照文件体系工作工作过程记录完善实验人员专业培训Thanks！