反相高效液相色谱的基本原理及其应用

('反相高效液相色谱的基本原理及其应用生物技术一班王梦宇41108218反相高效液相色谱是化学键合相色谱法的一种。化学键合相色谱法是由液液色谱法发展起来的,是为了解决在分离过程中,机械吸附在载体上的固体液的流失问题而发展出来的一种新方法。键合相色谱法通过将不同的有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶载体表面的游离经基上,而生成化学键合固定相,化学键合固定相对各种极性溶剂都有良好的化学稳定性和热稳定性。由它制备的色谱主柱效高、使用寿命长、重现性好,几乎对各种类型的有机化合物都呈现良好的选择性,并可用于梯度洗脱操作,消除了分配色谱法的缺点。根据键合固定相和流动相相对极性的强弱,可将键合色谱法分为正相键合色谱法和反相键合色谱法.反相键合色谱法即反相高效液相色谱.在正相键合色谱法中,键合固定相的极性大于流动相的极性,适用于分离油溶性或水溶性的极性和强极性化合物.在反相键合相色谱法中,键合固定相的极性小于流动相的极性适用于分离非极性、极性或离子型化合物,其应用范围也比正相键合相色谱法更为广泛。关于反相色谱的分离机理,吸附色谱的作用机制认为溶质在固定相上的保留主要是疏水作用,在高效液相色谱中又被称为疏溶剂作用。根据疏溶剂理论,当溶质分子进入极性流动相后,即占据流动相中相应的空间,而排挤一部分溶剂分子。当溶质分子被流动相推动与固定相接触时,溶质分子的非极性部分或非极性因子会将非极性固定相上附着的溶剂膜排挤开,而直接与非极性固定相上的烷基官能团相结合(吸附)形成缔合络合物,构成单分子吸附层。这种疏溶剂的吸附作用是可逆的,当流动相极性减少时,这种疏溶剂斥力下降,会发生解缔,并将溶质分子解放而被洗脱下来。反相色谱中疏水性越强的化合物越容易从流动相中挤出去,在色谱柱中滞留时间也长,所以反相色谱法中不同的化合物根据它们的疏水特性得到分离。反相色谱法适于分离带有不同疏水基团的化合物,亦即非极性基团的化合物。此外,反相色谱法可用于分离带有不同极性基团的化合物。可以通过改变流动相的溶剂及其组成和pH,以影响溶质分子与流动相的相互作用,改变它们的滞留行为。另外,反相色谱中水的流动相中占的比例伸缩性很大,可以从0一100%,从而使反相色谱可用于水溶性、脂溶性化合物的分离。反相色谱法中的固定相是被共价结合到硅胶载体上的直链饱和烷烃,其链的长短不同,最长的是十八烷基,这也是使用得最多的固定相。直链饱和烷烃疏水特性随着碳氢链的长度而增加,在反相色谱柱中溶质由于疏溶的有机溶剂,以得到不同强度的流动相,这些有机溶剂称为修饰剂。反相色谱中最常用的有机溶剂有甲醇和乙睛,此外,乙醇、四氢吠喃、异丙醇及二氧六环也常被用作修饰剂。烷基键合固定相对每种溶质分子缔合作用和解缔作用能力之差,就决定了溶质分子在色谱过程的保留值。以下简述影响溶质保留值的二个因素:l)溶质分子结构在反相键合相色谱法中,溶质的分离是以它们的疏水结构差异为依据的,溶质的极性越弱,疏水性也强,保留值越大。根据疏溶剂理论,溶质的保留值与其分子中非极性部分的总表面积有关,其与烷基键合固定相结出的面积愈人,保留值越人。2)烷基键合固定相的特性烷基键合固定相的作用在于提供非极性作用表面,因此键合到硅胶表面的烷基数量就决定着溶质容量因子的大小。烷基的疏水特性随碳链的加长而增加,溶质的保留值也随着烷基碳链长度的增加而增人。随着烷基碳链的增长,增加了键合相的非极性作用的表面积,其不仅影响溶质的保留值,还影响色谱柱的选择性,即随烷基碳链的加长其对溶质分离的选择性也增大。3)流动相性质流动相的表面张力愈大,介电常数愈大,其极性越强,此时溶质与烷基键合相得缔合能力越强,流动相的洗脱强度弱,导致溶质的保留值越大。目前,获得紫杉醇比较可行的方法是从红豆杉中进行提取分离,但由于红豆杉中紫杉醇的含量很低,并且存在很多与紫杉醇结构和性质非常接近的紫杉烷伴生物,如二尖杉宁碱,这种结构上的细微差别使得紫杉醇和三尖杉宁碱的分离十分困难。锥丽娜等人采用正相色谱和反相色谱法相结合的方法,在反相色谱中使用了一种新颖的高分子填料,成功分离提纯了紫杉醇和二尖杉宁碱,纯度达到98%以上,克服了传统方法的缺点在环境分析中,带硝基的有机化合物被广泛地用于制造火药,这类化合物的大量使用对环境造成严重的污染。虽然气相色谱法中常用的各类选择性检测器对于这类化合物的检测有很好的选择性及很高的灵敏度,但由于这类化合物的热不稳定性给定量测定带来困难,因此常选用液相色谱法分离检测。由于手性化合物的物理、化学性质相同,实现它们的分离就比较困难,如大多数氨基酸都有右旋体和左旋体,但往往只能获得右旋体和左旋体的混合物,即外消旋体。对于手性药物往往呈现一种对映体(R)具有强的生物活性和药效,而另一种对映体(S)却无药效,因此对手性药物对映体的拆分也是高效液相色谱分析的热点。Erlandssond等人通过改变色谱柱的固定相,在色谱柱内装填由5微升硅胶作基体的手性固定相,群殴独特的选择性使得右旋体和左旋体得以分离。通过以上例子,可以看出反相高效液相色谱法通过将不同的有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶载体表面的游离经基上,而生成不同极性的化学键合固定相,从而使这种方法的选择性得到提高且具有针对性。反相高效液相色谱所具有的柱效高、使用寿命长、重现性好,几乎对各种类型的有机化合物都呈现良好的选择性,并可用于梯度洗脱操作的优点,使得在生物化学与工程,医药研究,食品分析,环境污染和精细化工等领域都得到了广泛应用。',)