离子交换色谱法标准操作程序,离子交换色谱法的操作过程

('方法摘要：离子交换色谱（IonExchangeChromatography，IEC）以离子交换树脂作为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆变换。溶液pH低于C产品组分等电点PI时，组分带正电荷，可以跟固定相上的阳离子交换，吸附在固定相上，用盐浓度梯度洗脱时，组分按照表面正电荷从少到多的顺序被洗脱下来。紫外检测器检测280nm处的响应值，根据组分峰面积计算纯度。范围：适用于本公司生产出的C产品的中间产品、原液、成品及稳定性样品的电荷异质性分析。职责：操作人员：\uf0d8严格按照此规程要求进行操作。岗位主管：\uf0d8起草文件，并确保操作程序的准确性、技术内容的完整性及文件的及时更新；\uf0d8监督操作规程是否与实际过程一致，资源是否满足要求；\uf0d8培训，确保此操作规程的正确实施。程序：1术语解释无2试剂和材料\uf0d8色谱柱：阳离子交换色谱柱，例如MabPacTMSCX-10，4.0×250mm，10µm（Thermo）\uf0d8试剂：N-（2-乙酰胺基）-2-氨基乙磺酸（ACES，分析纯），氯化钠（NaCl，色谱纯），盐酸（HCl，分析纯），磷酸氢二钠（Na2HPO4，色谱纯），磷酸（H3PO4，色谱纯），纯化水（自制）\uf0d8滤膜：孔径为0.45µm或以下注：所用试剂可被同等或更高级别的试剂替代，但应证明适用；所有材料遵循厂家有效期。3仪器设备\uf0d8液相色谱仪：例如Agilent1260\uf0d8天平，精确到mg\uf0d8pH计\uf0d8溶剂过滤装置\uf0d8离心机（转速10000rpm以上）\uf0d8移液器（10-1000µl）第1页共5页4溶液配制4.1流动相配制4.1.1流动相A：20mMACES，pH6.20称取ACES3.64g，加入1000ml水搅拌至完全溶解，HCl调pH6.20±0.02；经0.45μm滤膜过滤，室温保存，有效期3天，使用前超声脱气15min。4.1.2流动相B：20mMACES，500mMNaCl，pH6.20称取ACES3.64g，NaCl29.22g，加入1000ml水搅拌至完全溶解，HCl调pH6.20±0.02；经0.45μm滤膜过滤，室温保存，有效期3天，使用前超声脱气15min。注：流动相调pH时，确认溶液温度在23~27℃。4.1.3色谱柱保存液：20mMNa2HPO4/H3PO4，pH6.5称量2.84gNa2HPO4，加入1000ml纯水搅拌溶解，用H3PO4调节pH值为6.50±0.02，使用0.45μm滤膜过滤后，2-8℃低温保存，有效期1个月。4.2样品溶液配制4.2.1参比品溶液配制取规定的参比品，根据蛋白浓度标示量，用制剂缓冲液稀释至5.0mg/ml，转移到样品瓶。例：参比品CDS20180209，蛋白标示量为22.0mg/ml，稀释4.4倍（40µl参比品+136µl制剂缓冲液），稀释后浓度为5.0mg/ml。4.2.2供试品溶液配制稀释方法同4.2.1。对于浑浊的样品，需经0.22μm的滤膜过滤，或者10000rpm离心10min，取上清液至样品瓶。5检测方法5.1色谱系统准备5.1.1打开sealwash（清洗液：10%异丙醇-水溶液）；更换洗针瓶（清洗液：水）；5.1.2以检测方法的流动相起始比例（流动相A：4%，流动相B：96%），1.0ml/min的流速平衡至基线平稳，至少20min。5.1.3关键色谱参数和洗脱梯度色谱参数流速1.0ml/min色谱柱温度40℃样品室温度设置4℃进样量50µg（10µl）第2页共6页检测波长280nm洗脱梯度Time（min）%流动相A%流动相B0.0092.08.03.0092.08.08.0010.589.540.0028.072.040.01100.00.050.00100.00.050.0192.08.060.0092.08.05.2进样序列样品进样针数备注NA1平衡色谱柱流动相A1NA制剂缓冲液1空白对照参比品3确定系统适应性供试品1样品数≤10参比品1确定系统适应性注：每检测10个供试品，需进参比品1次以确定系统适应性。5.3色谱柱清洗和保存序列运行结束，用100%流动相B以0.5ml/min的流速冲洗色谱柱不少于30分钟；用流动相A和流动相B（92:8）以0.5ml/min的流速冲洗色谱柱不少于30分钟，色谱柱保存在流动相A和流动相B（92:8）中。若色谱柱需保存超过1周，保存在色谱柱保存液中。6数据分析及报告6.1典型色图谱及色谱峰定义典型的C产品的HPLC色谱图应有五个显著的主峰。主峰区前的峰组为酸区，主峰之后的峰组为碱区。C产品的HPLC典型图谱和色谱峰定义见图1。第3页共6页图1C产品的HPLC典型图谱6.2积分基线撇去方式：经典；斜率灵敏度：0.2，峰宽：0.2，最小峰面积：2.0；最小峰高：0.1；积分时间：5~30min；以上参数仅供参考，可根据样品实际情况调整积分参数以保证基线平稳和积分一致，尽量避免手动积分，手动积分需主管确认和签字。6.3计算采用面积归一化法计算，OpenLABCDS软件计算各峰的峰面积以及除溶剂峰和样品Buffer峰外的总色谱峰面积，计算各组分区峰面积占总峰面积百分比的公式如下：6.4数字格式\uf0d8保留时间：小数点后3位；\uf0d8峰面积%：保留小数点后1位；\uf0d8RSD%：大于等于1.0时，保留小数点后1位；小于1.0时，保留小数点后2位；\uf0d8峰面积：整数；6.4接受标准\uf0d8参比品色谱图与L产品典型色谱图一致。\uf0d8主峰保留时间的RSD%不大于2.0。\uf0d8主峰区总峰面积%的RSD%不大于2.0。\uf0d8总峰面积的RSD%不大于2.0。6.5记录与报告填写记录《C产品纯度测定离子交换谱法实验记录》（R-A-0021-），保存色谱报告，按下表记录报告结果。系统适用性样品供试品第4页共6页酸性区%主峰区%碱性区%主峰保留时间总峰面积主峰区%RSD主峰保留时间RSD总峰面积RSD酸性区%主峰区%碱性区%参考文件：1.《中国药典》2015版第三部通则0512附件：1.离子交换色谱法（C项目）实验记录（共3页）R-A-0021-04历史：修订号生效日期修订内容012014-06-25新文件022015-01-011、适用范围项：“蛋白原液、制剂、中间产品”变更为“C项目的蛋白原液、制剂及中间产品的分析”。2、4．溶液配制项：“流动相有效期为1个星期”变更为“流动相、清洗液、保存液的储存条件为2~8℃，流动相有效期调整为1个月，每次使用前应重新调pH值，并经0.45μm过滤。”3、5.4数据分析及报告项：新增：色谱峰的定义，典型的C产品的CEX-HPLC图谱主峰区有5个峰，依次为峰1、峰2、峰3、峰4、峰5。主峰区之前各峰为酸性区，主峰区之后各峰为碱性区。4、5.4.1项：主峰纯度计算公式变更为目标峰纯度计算公式，增加相对保留时间计算公式。5、5.4.3项：“根据需要选择性打印进样的色谱图，同时打印仪器方法。”删除“同时打印仪器方法”。6、附件1中“4样品和对照品检测项”变更为“样品检测”：内容“每个样品平行检测两次”变更为“制剂及原液平行检测两次”，并增加序列表名称和使用市售对照品、自制对照品、空白对照的批号、厂家、取样日期。7、附件1中5报告结果项：增加系统适用性内容，包括色谱峰是否相似性和主峰区各峰保留时间的差异的判断。8、附件1中5报告结果项：增加“若样品进行两次检测，取第一针为检测结果。报告主峰区纯度结果。”031、根据修订后的《文件管理程序》（SMP-QA-001-02）要求修改本文件的形式。2、2.2仪器设备项：高效液相色谱仪，添加“Agilent1200”。3、4.1流动相“2-8℃低温保存，在1个月内使用，但每次使用前需要第5页共6页修订号生效日期修订内容重新调pH值，并重新过0.45μm滤膜”变更为“室温条件下有效期3天”4、4.2.3“样品经0.45μm的滤膜过滤”变更为“样品经0.22μm的滤膜过滤”5、5.4.2项中的“相对保留时间”公式删除。6、5.4.3“保留时间记录时保留小数点后两位”变更为“保留时间记录时保留小数点后三位”。7、5.4.4“根据需要选择性打印进样的色谱图”变更为“保存电子图谱并打印样品的色谱图”。8、正文及附件中所有的“对照品”统一变更为“参比品”，“空白对照溶液”变更为“制剂缓冲液”。9、4.1.2增加“注：调pH时，流动相温度必须恢复到室温；运行序列前确认pH在6.50±0.01范围内，记录最终pH。”10、4.1.4“在2个月内使用”更改为“在1个月内使用”041、4.1流动相配制项中流动相A和B的pH值均变更为6.20。增加调节pH值时的温度控制要求“流动相调pH时，确认溶液温度在23~27℃”。第6页共6页',)