荧光光谱分析技术概述,三维荧光光谱分析

('荧光光谱分析技术概述1荧光光谱分析原理........................................................................................................................12荧光分析法...................................................................................................................................42.1定性分析法.........................................................................................................................42.2定量分析法.........................................................................................................................41荧光光谱分析原理光学分析法分为光谱法和非光谱法，光谱法是辐射能与物质组成和结构的相互作用，以光谱的出来为基础，非光谱法不包含物质内能的变化，不涉及能级跃迁，而是辐射方向和物理性质的改变。光学分析方法分类表1分析法特征具体方法光谱法光的发射原子发射光谱、原子荧光光谱、X射线荧光光谱、分子荧光光谱、分子磷光光谱、化学发光、电子能谱、俄歇电子能谱光的吸收原子吸收光谱、紫外-可见分光光度法、红外光谱、X射线吸收光谱、核磁共振光谱、电子自旋共振光谱、光声光谱光的散射拉曼光谱非光谱法光的散射比浊法、散射浊度法光的折射折射法、干涉法光的衍射X射线衍射、电子衍射光的转动旋光色散法、偏振法、圆二向色法荧光发光机理可按量子理论通俗解释:光具有波动、粒子二重性,光波愈短,其光子能量愈强;反之波长愈长其能量则弱。当某些物质受到紫外线或较短波长光照射,吸收了全部或部分光能量,使其分子的能级升高而处于亚稳定状态,当恢复到稳定的基态时,这些分子就会立即释放多余的能量,其中一部分化为热量而消失。但对某些物质而言,向基态跃迁时是以“光”形式释放,因为有部分能量被消耗,所以重新发出的光能量总比吸收的能量要小。由于能量愈小,光波愈长,所以物质所激发的荧光总比照射它的光波要长。磷光的能量较荧光还要小,所以它的波长比荧光要长,寿命可达数小时之久,这就是两者的区别。如果物质的分子吸收了紫外和可见区电磁辐射后，它的电子能跃迁至激发态，然后以热能的形式将这一部分能量释放出来，本身又回复到基态如果吸收辐射能后处于电子激发态的分子以发射辐射的方式释放这一部分能量，再发射的波长可以同分子所吸收的波长相同，也可以不同，这一现象称为光致发光。最常见的两种光致发光现象是荧光和磷光。这两种光致发光的机理不同，荧光发光过程在激发光停止后10s内停止发光，而磷光则往往能延续10-3s-10s的时间间隔。因此，可通过测定发光寿命的长短来区分荧光和磷光。一些化学物质从外界吸收并储存能量而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量以电磁辐射的形式放射(即发光)称之为荧光。可产生荧光的分子或原子在接收能量后即刻引起发光，当激发光停止照射后，发光过程几乎立即停止。由化学反应所引起的荧光称为化学荧光，由光激发所引起的荧光称为光致荧光。按产生荧光的基本微粒的不同，荧光可分为原子荧光、X射线荧光和分子荧光。原子外层电子吸收电磁辐射后，由基态跃迁至激发态，在回到较低能态或基态时，发射出一定波长的辐射，即原子荧光。原子荧光又可分为共振荧光、直跃线荧光、阶跃线荧光、反斯托克斯荧光和敏化荧光。通过测量待测元素的原子蒸气在特定频率辐射能激发下所产生的荧光强度来测定待测元素含量的方法称为原子荧光光谱法。用初级X射线激发原子内层电子所产生的次级X射线称为X射线荧光。基于测量X射线荧光的波长及强度以进行定性和定量分析的方法称为X射线荧光分析法。处在基态的物质分子吸收激发光后跃迁到激发态，这些激发态分子在因转动、振动等损失一部分激发能量后，以无辐射跃迁下降到低振动能级，再从低振动能级下降到基态，在此过程中，激发态分子将以光的形式释放出所吸收的能量，称之为分子荧光，即通常所说的荧光。由于物质分子结构不同，所吸收光的波长和发射的荧光波长也有所不同。利用这个特性，可以定性鉴别物质。同一种分子结构的物质，用同一波长的激发光照射，可发射相同波长的荧光。若该物质的浓度不同，则浓度大时，所发射的荧光强度亦强，利用这个性质可以进行定量测定。以物质发射的荧光强度与浓度之间的线性关系为依据进行定量分析及以荧光光谱的形状和荧光峰对应的波长进行定性分析的方法称为荧光分析法，也称作分子荧光光谱法或荧光光谱法。在荧光分析中，将荧光分为自然荧光和人工荧光两种。自然荧光又称一次荧光、自发荧光、自体荧光或原发荧光，是指某些物质勿需经过处理，当受到激发光照射就能产生荧光的现象。人工荧光又称二次荧光、继发荧光、染色荧光，是指某些物质必须经过化学处理才能被激发产生荧光的现象。本文所述荧光为自然荧光。荧光物质产生荧光的过程可分为四个步骤：①处于基态最低振动能级的荧光物质分子受到紫外线的照射后，吸收了和它所具有的特征频率相一致的光线，从而跃迁到第一电子激发态的各个振动能级。②被激发到第一电子激发态的各个振动能级的分子，通过无辐射跃迁，降落到第一电子激发态的最低振动能级。③降落到第一电子激发态的最低振动能级的分子，继续降落到基态的各个不同振动能级，同时发射出相应的光量子，即荧光。④到达基态的各个不同振动能级的分子，再通过无辐射跃迁最后回到基态的最低振动能级。图1产生荧光的过程扫描激发单色器，使不同波长的入射光激发荧光物质，产生的荧光通过固定波长的发射单色器照射到检测器上，检测相应的荧光强度，记录荧光强度对激发光波长的关系曲线，即为激发光谱。激发光谱反映了不同波长激发光引起物质发射某一波长荧光的相对效率，可供鉴别荧光物质，在进行荧光测定时供选择适宜的激发波长。保持激发光的波长和强度不变，物质所产生的荧光通过发射单色器照射到检测器上，扫描发射单色器并检测各波长下相应的荧光强度，记录荧光强度对荧光发射波长的关系曲线，即为荧光光谱。荧光光谱表示荧光物质所发射的荧光在各种波长下的相对强度，可供鉴别荧光物质，并作为荧光测定时选择适当的测定波长或滤光片的根据。在建立荧光分析法时需根据荧光光谱来选择适当的测定波长或滤光片，这和分光光度法与比色法需根据吸收光谱来选择适当的测定波长或滤光片一样，因此荧光光谱对于荧光分析具有特定的意义。荧光光谱一般具有以下特征：①斯托克斯位移在溶液荧光光谱中，所观察到的荧光的波长总是大于激发光的波长，即在激发与发射之间存在着一定的能量损失。②荧光发射光谱的形状与激发波长无关由于内转化和碰撞振动弛豫的速度非常快，分子即使被激发到高于S1的电子态的更高振动能级，也很快地丧失多余的能量而衰变到S1电子态的最低振动能级，所以分子的吸收光谱可能有几个吸收带，但其荧光光谱却只有一个发射带。由于荧光发射发生于第一电子激发态的最低振动能级，而与荧光物质分子被激发至哪一个电子态无关，所以荧光光谱的形状通常与激发波长无关。③与吸收光谱的镜像关系荧光物质的荧光发射光谱和它的吸收光谱之间存在着“镜像对称”关系。荧光光谱的形成是激发态分子从第一电子激发单重态的最低振动能级(S1)辐射跃迁至基态(S0)的各个不同振动能级所引起的，荧光光谱的形状与基态中振动能级的分布情况有关。吸收光谱中第一吸收带的形成是由于基态分子被激发到第一电子激发单重态的各不同振动能级引起的，而基态分子在通常情况下是处于最低振动能级的，因此第一吸收带的形状与第一电子激发单重态中振动能级的分布情况有关。一般情况下，基态和第一电子激发单重态中振动能级的分布情况是相似的。根据弗兰克－康顿(Frank-Condon)原理，电子跃迁速率非常之快。假如在吸收光谱中某振动能级间的跃迁几率最大，其相反跃迁的几率也应该最大，因此荧光光谱和吸收光谱之间呈镜像对称关系。2荧光分析法2.1定性分析法分子荧光光谱法可测荧光物质的激发光谱和发射光谱两个特征光谱。因此，它对物质的定性鉴别可靠性更强。荧光定性分析常采用直接比较法，即将试样与已知物质并列于紫外光之下，根据它们所发出的荧光的性质、颜色和强度，来鉴定他们是否含有同一荧光物质。这种鉴定法不限于固体试样，也可用于液体试样也可将已知物质在数种不同溶剂中配成各种不同浓度和不同酸度的溶液而加以比较。进行定性分析时，通常要有纯品作对照，不但要比较激发光谱的一致性，而且还要比较发射光谱的一致性。2.2定量分析法荧光是物质在吸收光能之后发射而出，因此溶液的荧光强度与该溶液吸收光能的程度以及溶液中荧光物质的荧光量子效率有关。溶液被入射光激发后，可以在溶液的各个方向观测荧光强度。但由于激发光的一部分被透过，因此在透射光的方向观察荧光是不适宜的。一般是在与激发光束垂直的方向观测。溶液的荧光强度可用式（1）表示:（1）在一定的条件下，式中的ε为荧光物质分子的摩尔吸光系数；c为溶液中荧光物质的浓度；l为样品光程，I0是激发光强度，Yf是物质的荧光效率。溶液的荧光强度与溶液的浓度呈线性关系，这就是荧光分析法的定量依据。',)