STAR对端粒酶活性影响的研究

('第三军医大学研究生学位论文独创性声明秉承学校严谨的校风和科研作风，本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：垄望日期：竺生塑第三军医大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解第三军医大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第三军医大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为第三军医大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，可以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：垒童指导教师签名：隆墨日期：aaaa——篁三垩匿奎兰堡主兰垡笙苎英文缩写一览表英文缩写英文全名中文名称Abantibody抗体Ampampicillin氨苄青霉素APSammoniumpersulfate过硫酸铵bpbasepair碱基对cDNAcomplementaryDNA互补DNADAB3’一3一diaminobenzidine3\'-3一二氨基联苯胺ddH20doubledistillated双蒸水DEPCdiethylprocarbonate二乙基焦碳酸酯DMSodimethylSulfoxide二甲基皿枫DNAdeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸dN卯deoxyribonucleosidetriphosphate脱氧核苷三磷酸DTTDithiothreitol二巯基苏糖醇EBethidiLImbromide溴化乙锭EDT：Aethylenediamineteraaceticacid乙二胺四乙酸ELIsAEnzyme—linkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附实验G418genetlcln新霉素gravity离心力hhour小时HEhaematoxylinandeosin苏木精一伊红(染色)HEPESN一【2一hydroxyethl]piperazine一N，N一双(2一羟乙基)哌嗪一N一2(乙磺【2-ethanesulfonic】acid酸)HRPHorseradishperoxides辣根过氧化物酶hTRhumantelomeraseRNA人类端粒酶RNA组分hTERThumantelomerasereversetranscriptase人类端粒酶反转录酶hsp90heatshockprotein90热休克蛋白90IHCimmunohistochemistry免疫组织化学aa第三军医大学硕士学位论文Kbkilo—basepair千碱基对KDakilo—dalton于道尔顿mlnminute分钟mRNAmessengerRNA信使RNAMTTthiazolylblue噻唑蓝NCNitrOcellulose硝酸纤维素膜NCSNeonatebovinesenlm新生牛血清oDopticaldensity光密度oligooligonucleofide寡核苷酸PAGEpolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳PBSphosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液PCRpolymerasechainreaction聚合酶链式反应PCMphase—contractmicroscope倒置相差显微镜PEGPolyethyleneGlycol聚乙二醇PMSFphenylmethylsulfonyfloufide苯甲基磺酰氟RBMRNA—bindingmotifRNA结合基序RNAribonucleicacid核糖核酸RNaseRibOnuclease核糖核酸酶rpmrevolutionsperminute每分钟转速RT—PCRreversetranscription—polymerase逆转录聚合酶链式反应chainreactionSam68Src—associatedinmotosis．68Kda有丝分裂中Src结合蛋白，68KDaSDSsodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠SDS—PAGSodiumdodecylsalphatepoly十二烷基硫酸钠．聚丙酰胺凝胶EacrlamidegelelectrophpresisSPstreptavidinperoxidase链霉卵自素过氧化物酶(染色法)STARsignaltransductionandactivatorofRN信号转导和RNA活化蛋白TAEtris／acetate／(buffer)Tfis／乙酸电泳缓冲液TaqthermusaquaticusDNA(polymerase)牺热水生菌DNA(聚合酶)TBEtris／borateelectrophoresismuffer)TrisPY珊]酸电泳缓冲液TBStris．．bufferedsaline"Iris缓冲盐溶液aaaa第三军医大学硕士学位论文TEPltelomerase—associatedprotein1端粒酶相关蛋白1TEMEDteramethylethylene—diamineN—N—N’一N’一四甲基乙二胺T—STARtestes—signaltransductionand睾丸特异性信号转导和RNA活化activator0fRNA蛋白哺Strihydroxyaminomethane三羟甲基氨基甲烷WTlWilms’tumor】威尔姆氏肿瘤基因一13aaaa第三军医大学硕士学位论文TheStudyofT—STAREffectonTelomermeActivityAbstractobjective：ToinvestigatetheproteinexpressionofT·STARintumortissue，anditscorrelationwithhTERTandtheactivityofTelomerase．TostudytheaffectionandmechanismofthesenseandantisenseT—STARgeneonbiologicalcharacteristic，expressionofT—STARandhTERTandtelomeraseactivityinvitroculturetumorcells．Materialsandmethods：1．TheexpressionofT—STARin46casesoftumortissueand46casesofnormaltissueweredeterminedbyimmunohistochemistry,westernblot，andRT—PCR．TheexpressionofhTERTin46casesoftumortissueand46casesofnormaltissueweredeterminedbythemethodsmentionedabove，andthetelomeraseactivitiyinthe46casesoftumortissueweredetermindbyTRAPPCR-ELISA。ThenthecorrelationamongtheexpressionT·STAR，hTERTandthetelomeraseactivitiywasanalysed．2．MolecularcloningtechniquewasusedtOconstructtheantisenseT—STAReukaryoticexpressiionvectorpneo—STAR．AndthenstablytransfectingtheSenseandantisenseT—STAReukaryoticexpressionvectorandcontrolvectorpCl—neeandpEGFP—clintovitroculturetumorceilssuchasSGC-7901，A549，HCT-116andHepG2throughG418screening3．ThecellbiologicalcharacteristicandcellgrowthcurveaftertransfectedwithpEGFP-cl／T—STARandpneo—STARwereobserved．MeanwhilethechangesoftheexpressionlevelofT—STAR，hTERTandtelomeraseactivityweredetectedbyimmunohistochemistry,westernblot，RT-PCRandTRAPPCR-ELISA．Thecorrelationamongtheexpressionofpar一4,hTERTandtelomeraseactivitywereanalysed．Results：1．T-STARwaswidelyexpressedintumortissueandnormaltissueoflung，liver,stomach，colonandrecta,andtheexpressionintumortissuewasmuchhigherthaninnormaltissue．2．Ofthepositiveexpressioncell，T—STARwaschieflyexpressedinglandcells．T—STARwasexpressedmainlyincytoplasma，butalsoinnucleus．3．TheantisenseT—STAReukauyoticexpressionvectorpneo—STARwasconstructedsuccessfully．4．ThevariouseukaryoticexpressionvectorssuchaspEGFP—cUT·STAR，pneo—STAR，4aa第三军医大学硕士学位论文pEGFP·clandpcl—neoweretransfectedinto4kindsofvitroculturedtumorcells，suchasSGC一7901，A549，HepG2andHCT一116．Thosevectorwasexpressedavailablyinvitro．TheexpressionlevelofT—STARproteinincreased1-2timesinthecelltransfectedwithpEGFP·cl／T—STARanddecreased75—85％inthecellstransefectedwithpneo—STAR．5．OfthepositivecolonstablyuansfectedwithvariousvectorsafterG418screeing，thecolontransfectedwithpEGFP—cl／T—STARtransfomatedphaenotypedecreased，suchasgrowthslowered，thecolonsreduced，karyoplasmicratioincreased，thecellstransfectedwithpneo—STARchangedreversely．6．TheexpressionofhTERTwasaccordantwiththetelomeraseactivitythroughthestudyoftumortissueandvitroculturedtumorcells．7．TheexpressionofT—STARwaspositivelycorrelatedwiththeexpressionofhTERTandtelomeraseactivity．Thatmeans，theupregulationofT—STARexpressioncallleadstotheincreasingactivityofthetelomerase．Conclusion：1．T—STARwaswidelyexpressedintumortissueandnormaltissueoflung，liver,stomach，colonandrecta，andtheexpressionintumortissuewasmuchhigherthaninnormaltissue．2．TheantisenseT—STAReukaryoticexpressionvectorpneo—STARwasconstructedsuccessly．ThesenseandantisenseT—STARgeneeukaryoticexpressionvector(pEGFP—cl／T—STAR，pneo—STAR)andthecontrolvector(pEGFP—el，pcl’neo)wastransfectedinto4kindsofvitroculturedtumorcellssuchasSGC一7901，A549，HepG2andHCT一116．Thosevectorwasexpressedavailablyinvitro．3．T—STARmaybeinvolvedinthecellularsignaltransductionpathways；T—STARcandecreasethetransformatedphaenotypr,andinhibitcellgrowthandcolonformation．4．T—STARhasthepositivecorrelationwiththeexpressionofhTERTandtelomeraseactivity．ItmaybeupregulationtelomerasecativitythoughtphosphorylationthehTERTreversibilityoractasapre—mRNAalternativeregulatorofhTERT。Keyword：T—STAR；hTERT；telomerase；eukaryoticexpression；generegulation；vectorconstructed；immortalization；genetherapy．5aaaa第三军医大学硕士学位论文卜STAR对端粒酶活性影响的研究木摘要目的：探讨肿瘤组织中T—STAR蛋白表达与hTERT蛋白表达和端粒酶活性表达的相关关系，以及正、反义T，STAR基因真核表达载体转染对不同体外培养的肿瘤细胞的生物学特性、T—STAR表达、hTERT蛋白和端粒酶活性的影响及其可能机制，为进一步深入研究端粒酶活性调控提供线索。方法：1．收集肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、直肠癌组织标本共46例，以及每一癌组织标本中相应正常组织共46例。分别用免疫组化染色法、westernblot定量检测法、RT、PCR半定量检测法对所有组织中T—STAR的表达进行检测，同时用上述各种方法对癌组织中hTERT的表达进行检测，用PCR．ELISA法对癌组织的端粒酶活性进行检测，统计学分析T—STAR表达与hTERT表达和端粒酶活性的相关关系。2应用分子生物学技术，构建反义T—STAR基因真核表达载体pneo．STAR；用脂质体介导转染法将正、反义T-STAR基因真核表达载体(pEGFP-c1／T-STAR和pneo．STAR)，两种空质粒载体(pEGFP．cl，pcl—neo)分别转入体外培养的肺腺癌细胞株A549，胃癌细胞株SGC．7901，肝癌细胞HepG．2和结肠癌细胞株HCT—116细胞中，用G418筛选阳性转染细胞克隆后，对转染前后各株细胞的生物学特性、生长曲线进行观察，用免疫组化染色法、westernblot定量检测法、RT—PCR半定量检测法以及PCR—ELISA法对各细胞株的T—STAR表达、hTERT表达、端粒酶活性进行定性、定量检测，统计学分析以上各检测指标的相关关系。结果：1．T—STAR蛋白广泛表达于肺、胃、肝、结肠、直肠等组织中，但在这些部位的肿瘤组织中表达较之在正常组织中表达明显升高。2．在T—STAR阳性表达的组织中，T-STAR主要表达于腺体细胞，既表达于胞浆，也表达于胞核，但以胞浆表达占多数。3．成功构建了T—STAR反义基因真核表达载体pneo—STAR。4．将正、反义T—STAR基因真核表达载体成功转染入肺腺癌细胞株A549，胃癌细胞株SGC7．901，肝癌细胞HepG一2和结肠癌细胞株HCT一116细胞等4种体外培养肿瘤细胞中，且有效表达，使正义基因转染细胞中T．STAR蛋白表达水平平均升高121．63％，使反义基因转染细胞中T—STAR蛋白表达水平平均降低78．06％。6aa第三军医大学硕士学位论文5．经G418筛选获得的阳性克隆中，稳定转染正义T．STAR基因真核表达载体的各株细胞均出现转化表型下降，如生长速度变慢，细胞克隆数减少，核浆比增加等表现，以及胞质突起增多：而稳定转染T．STAR反义基因真核表达载体的各株细胞均出现转化表型增加，如生长速度变快，细胞克隆数增加，核浆比减少等。6．对肿瘤组织和体外培养细胞的研究表明：hTERT表达与端粒酶活性大多数情况下具有一致性。7．T—STAR表达与hTERT表达和端粒酶活性变化呈同向变化趋势，T-STAR表达升高时hTERT表达和端粒酶活性增加，反之减少。结论：1．T．STAR广泛表达于肺、胃、肝、结肠及直肠等部位的正常组织和肿瘤组织的腺体细胞中，但在肿瘤组织中的表达较之在正常组织中表达明显升高。2．成功构建了反义T—STAR基因真核表达载体pneo．STAR。将正、反义T—STAR基因真核表达载体成功转染入不同体外培养肿瘤细胞中，并有效表达，使T—STAR蛋白表达水平出现特异性升高或降低。3．T—STAR参与了肿瘤细胞的胞内信号传导过程；T—STAR可使细胞转化表型下降，对细胞生长、克隆形成起抑制作用。4．T—STAR对hTERT表达和端粒酶活性起正调控作用。T—STAR可能通过对hTERT蛋白的可逆性磷酸化调控和hTERTper．mRNA的选择性剪接两方面对端粒酶活性产生影响。关键词：T-STAR；hTERT,端粒酶；真核表达；基因调控；载体构建；永生化；基因治疗．aaaa第三军医大学硕士学位论文T—STAR对端粒酶活性影响的研究+刖吾自然界中不同种类的生物各有其相对固定的自身寿命界限，这是由物种的遗传特性所决定的。在这个自身寿命界限内，机体会经历一个生长发育、成熟以致衰老、死亡的过程。其中衰老是指机体内各细胞、器官和组织的功能不可逆转地、全面地、逐渐地丧失的过程，是机体自然死亡的必经之路。随着机体衰老的发生，各种衰老相关性疾病(age—relateddiseases)，即增龄性疾病，如老年性痴呆、骨质疏松、高脂血症、2型糖尿病、肿瘤、冠心病、高血压、动脉硬化等相继出现，并成为目前对人类健康危害最大，且尚无有效防治手段的一类疾病。因此对衰老本质的研究显得尤为重要。对衰老的研究较早，但实质性衰老理论探讨是从本世纪50年代开始的。1950年首届国际老年学会后，世界各国相继成立了各种不同形式的衰老研究机构，从不同角度对衰老本质进行多方面的研究，使衰老研究得到了广泛和深入的发展。其中有代表性的衰老理论有：程序衰老学说，错误成灾学说，自由基学说，交联学说，免疫学说，神经内分泌学说，代谢失衡学说，细胞凋亡学说，细胞衰老学说等等。近年来，在衰老理论研究方面一个较大新进展是关于端粒学说。端粒是线性染色体末端的一种特殊DNA结构，由简单重复序YI(TTAGGG)n及端粒结合蛋白组成。真核生物细胞的端粒长约10Kb，无编码意义，但具有防止染色体未端融合和降解、维持染色体完整性和稳定性的作用。由于普通DNA聚合酶不能完整复制线性DNA末端，端粒会随着细胞分裂次数的增加而逐渐缩短，以致染色体的结构和功能完整性下降。端粒酶是～种RNA信赖性DNA聚合酶，能催化复制端粒重复序列，端粒延长。端粒学说【l】认为：端粒随细胞分裂次数的增加而缩短，达到一定程度后启动某些信号，如细胞增殖调控基因等，使细胞停止分化并出现老化，即进入第一危机期(M1期)；此时细胞若被病毒(SV40T抗原)转化，或某些抑癌基因(如P53，Rb等)发生突变，则可使细胞越过M1期继续分裂，端粒继续缩短，并最终进入第二危机期(M2期)，此时染色体出现各种异常形态，细胞中某些端粒由于太短而失去功能，于是细胞死亡，但极少数细胞在此阶段激活了端粒酶，使端粒功能得以恢复，细胞越过+国家自然科学基金资助(NO．30271442)aa第三军医大学硕士学位论文M2期并获得永生化。该学说被众多实验室研究所证实。但该学说中的一些基本问题，如端粒酶的启动、关闭等调控机制目前仍不清楚，一还有待于进一步研究完善。另外，研究表明，生殖细胞、某些淋巴细胞、造血干细胞和肿瘤细胞可通过激活自身端粒酶活性以补偿端粒的丢失，使这些细胞自身永生化，从而表现出无限制增殖的特性。换言之，端粒的缩短是启动衰老的分子钟【2】，而端粒酶可催化复制端粒，从而延长细胞寿命。肿瘤细胞是永生化细胞的一种，具有较高的端粒酶活性。研究表明，正常细胞向肿瘤细胞转化时端粒酶活性升高，反之降低，因此端粒酶与肿瘤发生之间有着密切关系。正因为端粒一端粒酶与衰老和肿瘤发生之间的密切联系，端粒酶已成为目前研究衰老机制的重要内容和肿瘤的基因治疗新靶点。端粒酶活性的调控研究将对众多增龄性疾病的防治，制备体外永生化生物活性替代细胞以及细胞移植(如生物人工肝细胞、胰岛细胞移植)等具有积极意义。端粒酶是一种核糖核蛋白复合物，由六个部分组成，：hTR(humantelomeraseRNA)，TEPl(telomerase·associatedprotein1)，hTERT(humantelomerasereversetranscriptase)，hsp90(heatshockprotein90)，p23和dyskerinp】。RNA组分是合成端粒重复序列的内源性模版，包括模板区和一些附加序列，模板区的序列与端粒重复序列互补。RNA组分的基因在细胞从胚胎发生到成熟的过程中都连续不断地表达【4】。TEPl具有连接RNA组分和蛋白的功能【5】。hTERT是主要催化活性亚单位16]。分子伴侣hsp90和p23是可与hTERT结合的端粒酶亚基之一。研究表明，这两个分子伴侣跟蛋白复合体的组装和激活有关ndyskerin是boxH+ACAsnoRNAs的假尿苷合成酶组分，可与hTR相互作用，促进端粒酶RNA酶组分和核仁的相互作用，促进RNA酶对hTR的处理以及参与端粒酶全酶复合体的组装【8]。以上组分中，只有hTERT在端粒酶阳性的肿瘤细胞和永生化细胞中表达，是端粒酶活性调节的限速亚单位，也是正常细胞和肿瘤细胞端粒酶活性明显不同的原因所在。正常人体细胞(除生殖细胞、某些淋巴细胞、子宫内膜细胞和造皿于细胞外)不表达端粒酶活性，但可检出端粒酶RNA表达，而hTERT难以检出；端粒酶阳性的每个细胞都能检测到0．2．6条hTERTmRNA(正常细胞<0．004或者不能检出)tgj，在一些人体细胞转染hTERT基因后可使之出现端粒酶活性，而抑制肿瘤细胞中hTERT基因的表达则可抑制端粒酶活性。正因为端粒酶活性与hTERT的表达有很好的一致性，因此hTERT的调控被认为是端粒酶活性调控的关键环节。1999年起至今，一批学者从克隆和分析hTERT基因启动子区着手，辨认了该区的一些蛋白结合位点，从而发现了一些与该区结合的蛋白(如AP2，AP4，CCAC，c—Ets一2，c-Myb，c．myc，NFl，ER，IK2，Madl，MAZ，MyoD，CREB／ATF，Spl，aaaa第三军医大学硕士学位论文MZF一2，p53，wTl等)，并进一步研究证明了这蛋白对端粒酶活性确有调控作用。例如，c—myc可与hTERT启动子区结合，并对端粒酶活性呈正调控，用c—myc基因转染人乳腺上皮细胞和包皮角质细胞可激活端粒酶，反之转染反义C-myc基因可抑制肿瘤细胞的端粒酶活性；Akt可使hTERT的229和824位丝氨酸磷酸化激活端粒酶；p53可通过其羧基端区与TEPl结合而抑制端粒酶活性等等。但更多的研究资料表明，端粒酶活性的调控可能是多因子参与的多水平反馈网络系统，涉及转录水平、蛋白质相互作用以及蛋白质磷酸化等，其中从具体细节以至大概框架目前均不明了。最近，陈兵等f1o】在国家自然科学基金(No．39980010)资助下，基于蛋白质相互作用理论，以hTERT作为诱饵蛋白，利用使蛋白质相互作用研究有所突破的酵母双杂交系统技术，克隆与hTERT相互作用蛋白编码基因，经过GeneBank比对和免疫共沉淀验证判定，发现了一组与hTERT相互作用的蛋白丌一STAR、SMARCBl、par·4、NISCH、LOXL3、HKR3)。PubMed检索未发现这些蛋白与端粒酶有关的报道，但文献中除了其克隆和自身结构的研究外，还有一些与细胞永生化、RNA结合蛋白、wTl及肿瘤相关的报道，而这些因素又与端粒酶密切相关，结合该组蛋白与hTERT相互作用的证据，提示可能与hTERT和端粒酶活性的调控有关。为了进一步证实此组蛋白对端粒酶活性的影响，陈兵等再次申报国家自然科学基金并获得资助(No．30271442)。而本研究“T．STAR对端粒酶活性影响的研究”即为该资助项目的一部分。T—STAR是分子量为55KDa的STAR(signaltransductionandactivatorofRNA)家族新成员，是一种细胞生长抑制蛋白。T—STAR基因定位于染色体8q24．2，含9个外显子，cDNA片段大小为1．2．1．9kb左右，其mRNA长约2．4kb。T—STAR蛋白结构与其它STAR家族成员，尤其与SAM68(Src—associatedinmotosis，68KDa)高度相似，故又名SLM一2(Sam68．1ikemammalianprotein，AF099092)和Salpa(Sam68一likeproteind．AF051321)。STAR功能域是STAR家族成员的共同特征，含蛋白的RNA结合位点】。研究表明，T—STAR作为酪氨酸蛋白，RNA结合蛋白，通过参与酪氨酸蛋白激酶信号转导系统和靶pre—mRNA的选择性剪接、ijIlI[121等过程而参与了一系列重要的生理、病理过程，如参与精子发生‘1引、抑制细胞生长1141，参与永生化过程[15】和某些疾病的起病㈤，甚至对端粒酶活性的可能影响【10】等等。为进一步证实T—STAR蛋白对端粒酶活性的影响并探讨其可能机制，我们对一批临床组织标本中T—STAR蛋白表达(mRNA和蛋白水平)与端粒酶活性表达进行了相关lOaa第三军医大学硕士学位论文性分析。然后以一些具有永生化特性的体外培养肿瘤细胞为研究对象，利用正、反基因转染技术特异升高或降低培养细胞的T—STAR蛋白的表达水平，并对转染前后肿瘤细胞的端粒酶活性、hTERT表达以及细胞生物学行为的变化进行了分析研究。从组织和细胞、体外和体内、mRNA和蛋白、面和点几个方面探讨T．STAR蛋白对端粒酶活性的影响及其可能机制。鉴于此，本课题进行了以下几方面的研究工作：1)检测了人体不同组织(肿瘤和正常组织)标本中的T—STAR蛋白表达水平、端粒酶活性和hTERT蛋白表达水平，并进行相关性分析。2)获赠了全长正义T．STAR基因真核表达载体并鉴定之；自行构建了全长反义T—STAR基因真核表达载体并鉴定之。3)利用脂质体介导转染技术，将正、反义T—STAR基因真核表达载体转染入肺腺癌细胞A549，肝癌细胞HepG．2，胃癌细胞SGC．7901和结肠癌细胞HCT一116等不同体外培养肿瘤细胞中，特异性提高和降低T—STAR蛋白的表达水平，对转染前后细胞生物学特性、端粒酶活性、hTERT表达的变化进行分析研究，进一步探讨T—STAR对端粒酶活性的影响及其可能的影响机制。参考文献1．陈兵，刘为纹，房殿春。端粒酶研究概况【J】．世界华人消化杂志．2001，9(4)：441—4462．KimNW．Specificassociationofhumantelomeraseactivitywithimmortalcellsandcancer．Scienece．1994，266(5193)：2011-20153．HarleyCB，FletcherAB，GreiderCW：Telomeresshortenduringagingofhumanfibroblasts．Nature1990，345：458—460．4．FengJ，FunkWD，WangSS，eta1．TheRNAcomponentofhumantelomerase．Science(1995)269：12365．Collins，K．，Kobayashi，R．＆Greider，C．W．Puri．cationofTetrahymenatelomeraseandcloningofgenesencodingthetwoproteincomponentsoftheenzyme．Cell81，677—686，(1995)6．Meyerson，M．，Counter，C．M．，Eaton，E．N．，Ellisen，L．W．，Steiner，P．，Caddie，S．D．，Ziaugra，L．，hEST2，theputativehumantelomerasecatalyticsubunitgene，isup—regulatedintumorcellsandduringimmortalization．Cell90，785—795．(1997)7．Holt，S．E．，Aisner，D．L．，Baur，J．，Tesmer，V．M．，Dy，M．，Ouellette，M．，Trager，J．B．，11aaaa第三军医大学硕士学位论文Morin，G．B．，Toft，D．0．，Shay，J．W．，Wright，W．E．＆White，M．A．Functionalrequirementofp23andhsp90intelomerasecomplexes．GenesDev．13，817～826．(1999)8．Mitchell，J．R．，Cheng，J．＆Collins，K．(1999)AboxH／ACAsmallnuclearRNA—likedomainatthehumantelomeraseRNA3Cend．M01．Cell．Bi01．19．567—576．Mitchell，J．R．，Wood，E．&Collins，K．Atelomerasecomponentisdefectiveinthehumandiseasedyskeratosiscongenita．Nature402，551-555．(1999)9．KondoS，KazuoY，LeslieA，eta1．Actisensetelomerasetreatment：Inductingoftoodistinctpathways，apoptosisanddifferentiation．ProcAmAssocCancerRes．1997，38(2)；505—508．10．人端粒相关基因克隆的新策略，国家自然科学基金No．3998001011．DiFruscioM，ChenTandRichardS，CharacterizationofSam68一likemammalianproteinsSLM—landSLM一2：SLM一1isaSrcsubstrateduringmitosis[J]．Proc．Natl．Acad．Sci．1999．96(6)：2710-2715．12．Stoss0，OlbfichM，HartmannAM，eta1．TheSTA剐GSGFamilyProteinrSLM-2RegulatestheSelectionofAlternativeSpliceSites[J]．J．Bi01．Chem，2001，276(12)：8665—8673．13．VenablesJP，VernetC，ChewSL，eta1．T—STAR厄TOILE：anovelrelativeofSam68thatinteractswithanRNA-bindingproteinimplicatedinspermatogenesis[J]．Hum．M01．Genet，1999，8(6)：959-969．14．LeeJSandBurrJG：Salp，andSalpB，growth—arrestinghomologsofSam68[j]．Gene，1999，240(1)：133—147，15．KoolJ，vallZaaneW，vanderEbAJ，eta1．Down—regulationofT—STAR，agrothinhibitoryprotein，afterSV-40一mediatedimmortalization[J]．CellGrothDiffer，2001，12(11)：535—41．16．SugimotoY，MoritaR，AmanoK，eta1．T-STARgene：finemappinginthecandidateregionforchildhoodabsenceepilepsyon8q24andmutationalanalysisinpatients[J]．EpilepsyRes，2001，46(2)：139—44．12aa第三军医大学硕士学位论文第一部分T—STAR与端粒酶活性相关性研究刖吾端粒是线性染色体末端的一种特殊DNA结构，由简单重复序YIJ(TTAGGG)n及端粒结合蛋白组成，具有防止染色体末端融合和降解、维持染色体完整性和稳定性的作用。端粒酶是一种RNA信赖性DNA聚合酶，能催化复制延长端粒并维持端粒稳定，对衰老和肿瘤发生起着重要作用。端粒酶活性与其催化亚基hTERT(humantelomerasereversetranscriptase)的表达密切相关。目前对端粒酶活性的调节主要集中在对hTERT的表达调控上。我科研究小组通过酵母双杂交系统技术和免疫共沉淀技术，发现了T—STAR可与hTERT发生相互作用，文献发现该蛋白与细胞永生化、蛋白的磷酸化调控及靶pre—mRNA剪接加工有关，而这些又与端粒酶密切相关，结合该蛋白与hTERT相互作用的证据，提示可能与hTERT和端粒酶活性的调控有关。为了进一步明确T—STAR蛋白与hTERT蛋白和端粒酶活性是否有相关性，T—STAR蛋白对hTERT蛋白和端粒酶活性是否有调节作用，我们检测了正常组织和肿瘤组织中T—STAR表达、hTERT表达和端粒酶活性表达情况，并进行相关性分析。材料与方法一、材料1．组织标本：本研究所用组织标本均取自本院住院肿瘤病人，为手术切除的癌组织和同一标本的相应正常组织各46例。其中肺癌及正常肺组织各13例；胃癌及正常胃组织各11例；肝癌及正常肝组织各9例；结肠癌及正常结肠组织各8例；直肠癌及正常直肠组织各5例。取得标本后立即用无菌刀片分装成4份，一份冻存于一80。C，用于总蛋白提取；二份冻存于液氮中，用于mRNA提取和端粒酶活性测定；一份立即置于4％多聚甲醛液中固定，24小时后取出，石蜡包埋，常规切片，记录切片号和病理号(一周后于病理科采集)，用于免疫组织化学检测。2．实验器材CJ一2FD超净工作台(苏净集团安泰公司)7MQ．R一3850型自动台式灭菌器(山东新华医疗器械股份有限公司)HQZ—X100怛温振荡箱(哈尔宾东明医疗仪器厂)aaaa第三军医大学硕士学位论文SmartSpec7M3000型核酸蛋白仪(美国BioRad公司)DKB一8A型电热恒温水浴箱(上海精宏设备有限公司)FormaScientific超低温冰箱(德国forma公司)Model．828型PH测试仪(美国ORION公司)JA2003A电子天平(上海精天电子仪器有限公司)JYl002型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)WD800T烧烤型微波炉(Galanz公司)2K一15型冷冻离心机(美国Sigma生物公司)BCD．272型一20℃冰箱(Kelon公司)DYY．6B型稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂)DYY．Ill型786电泳槽(北京六一仪器厂)Eppendorf5415D微量离心机(德国Eppendorf公司)ZF．4型Kodak凝胶成像紫外透射仪(上海精天电子仪器有限公司)垂直电泳槽(北京六一仪器厂)电转移装置(北京六一仪器厂)JY92．II型超声波细胞粉碎机(上海新芝生物技术研究所)Hw一8B型超级微量恒温器(上海浦江分析仪器厂)WSZ一100．A振荡器(上海新芝生物技术研究所)550型酶标仪(美国BioRad公司)低温冷冻离心机(美国Sigma公司)BioRad扩增仪(美国BioRad公司)OLYMPASBX4l正置显微镜(日本OLYMPAS公司)Spotinsightcolor图像采集系统(日本OLYMPAS公司)BioRadGelDos200凝胶成像系统(美国BioRad公司)3．试剂3．1主要试剂T—STAR(sc一9475)多克隆抗体(美国SantaCrusBiotechnology公司)TERT(sc一7214)多克隆抗体(美国SantaCrusBiotechnology公司)Rabbitanti·-goatIgG··HRP(ZB—·2306)(北京中山生物技术公司)免疫组化染色试剂盒(北京中山生物技术公司)DAB试剂盒(北京中山生物技术公司)14aa第三军医大学硕士学位论文DNAmarker(100bp)(鼎国生物技术公司)Proteinmarker(美国MBI公司)RNAPCRKrr(大连宝生物公司)TaqDNApolymerase(美国Promega公司)TeloTAGGGTelomerasePCR—ELISAKIT(美国roche公司)dNTP(上海生物工程公司)DEPC(美国roche公司)PBS溶液(华美生物公司)硝酸纤维薄膜(NC)(美国Promega公司)琼脂糖(西班牙Amerse公司)溴化乙锭(美国Sigma公司)溴酚蓝(上海生物工程公司)DAB(美国Sigma生物公司)牛血清白蛋白(BSA)(华美生物公司)其它试剂：丙烯酰胶，亚甲丙烯酰胺，SDS，Tris碱，甘氨酸，甲醇，冰乙酸，Tween一20，甘油，过硫酸铵多聚甲醛，TritonX一100，去氧胆酸钠，氟化钠，PMSF，NP．40，EDTA，叠氮钠(NaN3)等均为国产分析纯试剂。3．2试剂配制3．2l4％多聚甲醛液：称取40克多聚甲醛加于800ml0．1MPBS溶液中，60℃下加热使之缓慢溶解完全，然后加PBS至1000ml，4"C保存备用。3．2201％DEPC水：取ImlDEPC加于1000ml双蒸水中，振荡溶解，室温保存备用。3．2，3免疫组化一抗稀释液(o．2％BSA／0．05％NaN3／PBS)：BSA0．29最终浓度0．2％NaN5O．059最终浓度O．05％0．1％PBS溶液100ml，过滤保存。3．2．4EDTA抗原修复液：称取EDTAO．2379溶于1000mlPBS溶液中，调至pH9．0，室温保存。32．5PMSF储存液：称取1．74克PMSF溶于10ml异丙醇，4℃保存备用。3．2，6RIPA蛋白提取液的配制：Tris—HCI(1mol／L，pH7．4)0．5ml最终浓度50mM1Saaaa第三军医大学硕士学位论文NP一40lml最终浓度1％Na—deoxycholateO．259最终浓度0．25％NaCI：O．8759最终浓度150mMEDTA(O．5mol／L)0．2ml最终浓度1mMPMSF(1mol／L)0．1lml最终浓度1mMNaF4mg最终浓度1mM加双蒸水至100ml，过滤后室温保存。使用前分别加入Aprotinin，leupeptin，pepstatin至终浓度均为Iug／ml。3．2．7Bradford法测定蛋白含量测定试剂的配制：100mg考马斯亮蓝G250溶于95％酒精50ml，加入85％磷酸100ml，加双蒸水至1000ml，过滤后室温保存。3．2．82XSDS上样缓冲液lmlo／LTris—HclpH6．85m1lmlo／LDTTlOml(1临用时加)SDS2．09溴酚蓝O．19甘油lOml加ddH20至lOOml3．2．930％(w／v)凝胶贮存液丙烯酰胺29．Og亚甲丙烯酰胺1．Og加ddH20至100ml，滤纸过滤后，棕色瓶中4℃保存。3．2．101．5mol／LTris—HCI，pH8．8Tris碱18，159用1moVLHCI调至pH8．8加ddH20至3．2，111．Omol／LTris—HCl，pH6．8Tris碱12．19用lmol／LHCl调至pH6．8加ddH20至100ml3．2．1210％电泳分离胶(30m1)16aa第三军医大学硕士学位论文ddH2015．9ml30％丙烯酰胺溶液10ml1．5mol／LTris—HClpH8．87．5mllO％SDS0．3ml10％过硫酸胺0．3mlTEMEDO．012ml3．2．1312％电泳分离胶(30rnl)ddH209．9ml30％丙烯酰胺溶液12ml1．5mol／LTris—HCIpH8．87．5ml10％SDS0．3ml10％过硫酸胺0．3mlTEMED0．012ml3．2．145％电泳浓缩胶(10m1)ddH206．8ml30％丙烯酰胺溶液1．7ml1．5mol／LTris—HCIpH8．81．25mllO％SDS0．1ml10％过硫酸胺O．1mlTEMED0．01ml3．2．155×Tris一甘氨酸电泳缓冲液Tris碱15．19甘氨酸94．OgSDS5．Og加ddH20至1000ml3．2．1610％SDSSDS10．Og加ddH20至100ml3．2．1710％APSAPS0．19ddHzOlml17aaaa第三军医大学硕士学位论文3．2．18考马斯亮蓝R250染色液甲醇50mlddH2040ml冰乙酸10ml考马斯亮蓝R250O．2593．2．19脱色液甲醇50mlddH2040ml冰乙酸10ml3．2．20电转移缓冲液：甘氨酸2．99(39mmol／L)Tris碱5．89(48mmol／L)SDSO．379(0．37％)甲醇200m1(20％)加ddH20至1000mi3．2．2110mmol／LPBS(pH7．5)，用时稀释10倍PBS混合溶质l包加ddH20至1000ml3．2．2210mmol／LPBST(pH7．5)：1000mlPBS中加入0．5mlTween一203．2．2310XTBS：10ram01／LTris—HCI，pH7，5150mmo／LNaCI配法：Tris碱12．19NaCl87．669ddH．O900ml，以lmmoULHCI调pH值至7．5加ddH20至1000ml3．2．24DAB显色液(现用现配)lXTBS．pH7．510mlDAB6mg30％H20210ullSaa第三军医大学硕士学位论文3．2．25丽春红染色液丽春红S0．19冰乙酸5ml加ddH20至100ml3．2．26封闭液：1％(M／V)脱脂奶粉，溶于PBST中。二、实验方法1．免疫组织化学检测各组织标本中T—STAR蛋白的表达1．1组织切片的制备：载玻片的处理：普通载玻片浸浓酸过夜，自来水冲洗2小时，再用蒸馏水反复冲洗3遍，调温烤箱102。C过夜，干后涂防脱片剂多聚赖氨酸，干后装盒备用。已经固定的组织标本送病理科制备组织石蜡切片备用。1．2免疫组织化学实验操作流程(1)将石蜡切片置65℃烘烤过夜，使切片与载玻片紧密固定。(2)石蜡切片常规脱蜡至水，用PBS液振洗2次，3min／次。(3)在切片上滴加3％H202，室温孵育10min，消除内源性过氧化物酶活性。(4)用蒸馏水冲洗后，置PBS溶液浸泡5min；然后置lmMEDTA抗原修复液中，用微波炉加热至95。C，持续15min，避免沸腾；室温静置20—30min，使之自然冷却，蛋白复性。(5)用PBS漂洗两次，每次2min；滴加适量0．5％TritonX一100溶液，37。C孵育10min。(6)弃去0．5％TritonX．100溶液，滴加与二抗一致的抗原封闭血清覆盖细胞，37。C孵育15min，封闭非特异抗原位点。(7)轻轻弃去封闭孵育液，滴加含T—STAR多克隆抗体(1／100稀释)的一抗稀释液，4。C孵育过夜。(8)将4。C过夜孵育的切片置室温下30min；PBS充分冲洗3次，5min／次，以除去非特异吸附的抗体。(9)置PBST溶液中2min，滴加生物素标记二抗工作液，370湿盒孵育45—60min。(10)PBS漂洗3次，5min／次；滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素一卵白素工作液，25。C孵育15min；PBS漂洗3次，5min／次。nD呈色：按照DAB试剂盒说明进行操作，配制DAB显色液，滴加到组织切片上显色10—15min，同时于显微镜下观察并控制显色速度，终产物为棕褐色沉淀。自来19aaaa第三军医大学硕士学位论文水充分冲洗，复染、封片。显微镜下观察切片中T—STAR蛋白的表达情况，记录结果。1．3结果判断T—STAR蛋白免疫组化阳性产物呈棕黄色细颗粒状，定位于胞质内或胞核内。根据染色强度分别记为：(一)细胞无明显染色；(±)细胞着淡黄色：(+)细胞着黄色或者浅棕色；(++)细胞呈棕色或深棕色。2．WesternBlot检测各组织标本中T—STAR蛋白的表达2．1组织总蛋白提取：将．80℃保存的组织块称量后放入干净的玻璃匀浆器中：以lml／100mg组织的量加入组织裂解液(RIPA)，以10ul／100mg组织的量加入蛋白酶抑制剂PMSF：冰上匀浆，然后冰浴30min，其中每10min振摇一次；离心：4。C，200009，30min：最大功率超声打碎DNA；将上清移至另一干净1．5mlEp管中，一20。C保存备用。2．2蛋白浓度检测：用BioRad核酸蛋白仪测定提取液的蛋白浓度(按仪器操作说明进行)。2．3SDS—PAGE电泳(1)将玻璃板先后用洗衣粉、无水乙醇处理并干燥后，固定于垂直鱼泳槽上，用0．8％琼脂糖密封玻璃板边缘。(2)据蛋白分子量不同分别配制不同浓度的分离胶，本实验分离T—STAR蛋白时用12％电泳分离胶。(3)将配好的分离胶迅速灌入玻璃板夹层中，留出浓缩胶所需空间(梳齿长度再加lcm)，然后用双蒸水封面促进聚合，并使胶面保持平整。(4)待分离胶聚合完全后(约需30min)，将覆盖的液体倒掉，滤纸吸干液体。(5)配制5％浓缩胶，灌入浓缩胶，插入干净的Teflon梳子(避免气泡)，室温放置使其聚合(约需1小时)。(6)样品处理：按每泳道50ug总蛋白计算应加样品量，用RIPA补足10ul，加入待体积2×SDS加样缓冲液，加热：100C，5min，冷却后加样。(7)加样：浓缩胶聚合完全后，小心拨去梳子；用双蒸水冲洗梳孔，去掉未聚合的浓缩胶液，滤纸吸干；用注射器针头把齿孔弄平整，加入l×Tris一甘氨酸电泳缓冲液；据加样孔体积加入处理好的蛋白样品。(8)电泳：接通电源(正极接下槽)，浓缩胶8V／cm，分离胶15V／cm，电泳至溴酚蓝达分离胶底部，关闭电源。(9)剥胶：拆开电泳装置，小心取下含有目的蛋白的分离胶，一部份用于考马斯亮蓝染色，一部份用于转膜。如aa第三军医大学硕士学位论文(10)染色：将凝胶置于考马斯亮蓝染色液中(至少5倍体积于凝胶)，室温下振摇染色过夜；然后换成脱色液振摇脱色，每隔3小时换液一次，直至背景干净、条带清楚为止；凝胶成像仪上照相记录后于密封袋中保存。2．4电转移(1)将用于转膜的凝胶量好尺寸，切角做为标记。(2)戴手套，切大小与凝胶相吻合的6张3mm滤纸和1张NC膜。(3)将转移缓冲液倒入平底托盘中，将电转移时所用的两张夹层泡沫浸于其中，赶尽气泡。(4)把NC膜及滤纸漂浮于转膜液面上(NC膜正面朝上)，借毛细作用使之从下往上湿润后，于水中静置5min以去除滤膜上的气泡。(5)按下法安装转移装置：①平放底部夹层泡沫。②在底部泡沫上依次逐层放置：3张滤纸，凝胶，NC膜和3张滤纸。⑤平整覆上另一个夹层泡沫。其中，各层严格对齐，层间除尽气泡，NC膜正面朝向凝胶。(6)以凝胶在阴极，NC膜在阳极的方向插入电转移槽中，连接电源，进行电转移，转移T．STAR蛋白的条件为：100mV，2小时。(7)断开电源，拔下插头，从上到下拆卸转移装置，逐一掀去各层。将凝胶进行考马斯亮蓝染色，检查蛋白质转移是否完全。(8)将NC膜置去离子水中漂洗一下，除去残留转移液。(9)将NC膜置丽春红S染液中约30秒，观察蛋白是否转移至NC膜上，显色后立即用双蒸水漂洗干净。2．5免疫检测(1)NC膜放入封闭液中(液体量以没过NC为准)，20。C，60rpm，2h。(2)以l：100的稀释度将一抗直接加入封闭液中，封口，20。C，60rpm，12h。(3)弃去一抗液，用PBST洗4—5次，60rpm，10rain／次。(4)用封闭液稀释酶标二抗(1：2000)，将此二抗稀释液加入放置NC膜的平皿中(液体量以没过NC膜为准)，封口。20。C，60rpm，2h。(5)弃去二抗液，将NC膜用PBST洗4—5次，60rpm，10mird次。(6)显色：①配制DAB显色液，加入装NC膜的平皿中。②于室温(20。C左右)轻轻摇动，密切观察条带是否出现。③待所需条带出现到一定程度后，用蒸馏水洗膜终止显色反应。aaaa第三军医大学硕士学位论文④凝胶成像仪上照相记录后避光保存。2．6结果记录：用Biorad图像采集系统对所有westernBlot免疫检测结果进行采集，然后用Quntityone图像分析软件测定所采集图像目的条带的负相光密度。每例组织测三次，蛋白表达定量水平用目的条带的负相光密度值表示(x±S)3．RT—PCR检测各组织标本中T—STARmRNA表达水平3．1PCR引物的设计和合成：采用primepremier应用软件设计以下引物序列，各条引物由上海生物工程公司合成。具体序列见下表：3．2总RNA提取(Tripure法)：以下各步聚均为无菌操作，所有器具均经过RNA酶灭活处理。(1)从液氮中取出标本，称取约100mg组织，放入玻璃匀浆器中，加入lmlTripure，冰上充分碾磨。(2)碾磨后的混合液转移到经DEPC处理的1．5mlEp管中，室温下孵育5min，以确保核蛋白复合体完全分离。(3)向混合液中加入氯仿(o．2ml氧仿：lmlTripure)，加盖，用力振荡15秒；室温下孵育2-15min：离心：4oC，120009，15min，使溶液分离成三相(注：离心速度不超过120009)。(4)将Ep管中无色液相的上层溶液(约占Tripure分离试剂总体积的60％)转入一新的Ep管中，通过以下步骤沉淀RNA。(5)加入异丙醇(O．5ml异丙酵：lmlTripure)，加盖后上下颠倒数次使液体充分混匀；室温下孵育5-10min使RNA沉淀；离心：40C，120009，10min，弃上清。(6)加入75％乙醇(75％乙醇lml：lmlTripure分离试剂)；旋涡振荡洗涤RNA沉淀；离心：40C、75009、5min，弃上清。(7)空气干燥或真空条件下5—10min干燥样本，除去多余的乙醇。(8)用DEPC处理的无RNA酶双蒸水重悬RNA沉淀，移液器吹打数次使RNA沉22aa第三军医大学硕士学位论文淀溶解，55—600C孵育10—15min。(9)用BioRad核酸蛋白仪测定所提总RNA浓度、纯度，置．80。C冻存备用。3．3RNA逆转录生成cDNA每个样本各取总RNAlug于不同的PCR管中，每管中均加入DEPC处理的ddH20至9．5ul；另取一PCR管，不加任何样品(即RNA模板)，直接加DEPC处理的ddH209．5ul作为阴性对照；以上各管置700C水浴5min，然后置冰上2min，(以下步骤冰上操作)依次加入MgCl4ul，10xRTbuffer2ul，dNTPs2ul，Oligo(dt)15引物lul，Rnasin核酸酶抑制剂0．5ul，AMV逆转录酶lul，混匀；42。C保温lh；95。C，5min，灭活AMV。3．4PCR扩增T—STARcDNA在两个200ulEP管中均加入逆转录cDNA10ul，MgCl23ul，10"RTbuffer4ul，灭菌水33ul，Taq酶0．5ul；将T—STAR特异性上、下游引物各3ul，6一actin特异性上、下游引物各3ul加入到不同EP管中，在相同条件下进行PCR扩增，反应条件如下：950C5min第一部：变性950C45s35个循环第二部：退火480c30s第三部：延伸720Clmin第四部：延伸720C10min保温40c20min或更长3．5PCR半定量分析T—STAR基因片段的表达水平取以上PCR反应产物各5ul，按常规操作步骤进行I．5％琼脂糖凝胶电泳，以DNAMarker作分子量标准，用BioRadGelDos200凝胶成像系统测定T—STAR基因片段的光密度值，为消除系统及定量误差，以人B—actin基因序列作为内参照，以待测T—STAR基因片段实测光密度值／人13．actin光密度值的比值代表T+STAR基因mRNA表达的相对含量，记录结果。4．免疫组织化学捡测各组织标本中bTERT蛋白的表达实验方法步骤与1．0部分相同，其中一抗稀释度为1／50。5．WesternBlot检测各组织标本中hTERT蛋白的表达实验方法步骤与2．0部分相同，其中分离TERT蛋白时用10％电泳胶；电转移TERTaaaa第三军医大学硕士学位论文蛋白的条件为：100rnV，4小时；免疫检测时，TERT多克隆抗体稀释度为1：50，二抗稀释度为1：2000。6．RT-PCR检测各组织标本中hTERTmRNA水平用primepremier应用软件设计以下引物序列，送上海生物工程公司合成。具体序列见下表：其余各操作步骤与前面3．O章节相同。7．各组织标本中端粒酶活性的检测(按Roche公司TeloTAGGGTelomerasePCRELISA试剂盒操作说明进行)7．1组织提取物的制备：以下各步聚均为无菌操作，所有器具均经过RNA酶灭活处理。(1)将一80。C保存的组织标本用无菌刀片切成薄片，立即转入预先加入200ul冰浴预冷的裂解液的匀浆器中，冰上碾匀组织。(2)置冰上孵育30min，其间用吸管吹吸3次。(3)离心裂解物：16000。g，20min，2—8。C。(4)小心将上清转入另一无菌Ep管中。(5)将提取物分装后于液氮急冻后置一80℃保存。7．2TRAP反应7．2．1反应体系：(冰上操作，PCR管)2x反应混合物25ul样品提取液1-2ul玉苴盔23：2垒丛i总体积50ul7．2．2延长和扩增aa第三军医大学硕士学位论文steptimetemperatureStep／cycles1引物延长10．30min25℃Stepl2端粒酶失活)mln94℃Step23扩增变性30s94℃30Cycles退火30s50℃聚合90s72℃10min72℃Step34．保持4℃Step47．3杂交和ELISA过程(1)将变性液(溶液3)以20ul／份样品的量加入到不同无菌Ep管中，(2)加入5ul扩增产物，置15．25。C，10rain。(3)加入杂交液(溶液4)225ul／份样品，旋涡振荡，充分混匀。(4)取100ul杂交产物于预先包被好的MTP板中(试剂盒中提供)，盖上盖子以防水份蒸发，置37"C，300rpm，2h。(5)移去杂交液，加入洗脱液(溶液5)洗脱，250ulx3次／：fL，至少30s／次。小心移去洗脱液。(6)加入100ulAnti．DIG—POD工作液(溶液11)，盖上盖，15·25"C(18—22。C)，300rpm，30rain。(7)彻底移去液体。加入洗脱液(溶液5)洗脱，250ulx5次／孔，至少30s／次。小心移去洗脱液。(8)加入100ulTMB底物溶液(溶液8，预热至室温)盖，置15—25"C，300rpm，10—20rain，使其显色。加入100ul终止液(溶液9)。(9)加入终止液30min内于550型酶标仪上分别读取450nm和690nm的吸光度。7．4结果判断：A：阴性对照：阴性对照样品最大值应不超过O．25A450。。一A690。。。B：阳性对照：显色反应20min左右阳性对照的最大值应不小于1．5A4s011111-A690nm。C：样品：样品的吸光值大于0．2A450。。一A690。。为阳性。8，统计学分析：用SPSSl0．0统计分析软件对所有实验结果进行相应统计学分析。aaaa第三军医大学硕士学位论文结果一、免疫组织化学检测不同组织的T-STAR蛋白表达：T—STAR蛋白在肿瘤组织和正常组织各46例中的的表达情况见表l和图1。从表中可看出：①T—STAR蛋白在肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、直肠癌及其相应正常组织中都有表达。②T—STAR蛋白在所有癌组织的总表达率为40／46(86．96％)，在所有正常组织的总表达率为28／46(60．87％)，在两种组织的表达率之间有非常显著差异(po05)：②T．STAR蛋白在肺腺癌的腺上皮中呈强阳性表达，而在肺鳞癌的上皮细胞中几乎不表达；⑤在T．STAR蛋白阳性表达的肺组织中，胞浆、胞核均有表达，但以胞浆表达占多数。照片1为T．STAR蛋白在肺癌中的表达，照片2为T．STAR蛋白在正常肺组织的表达。2．T．STAR蛋白在胃组织中的表达：①11例胃癌组织中，T．STAR蛋白表达率为11／11(100％)，13例正常胃组织中，T-STAR蛋白表达率为7／1K63．6％)，且以弱阳性为主(5／7)，说明T．STAR蛋白在胃癌中表达相对较多，统计分析二者之间有显著性差异(p0)；②端粒酶活性与hTERTmRNA表达水平、hTERT蛋白表达水平和T·STAR蛋白表达水平的相关性均具有统计学差异(p0．05)。表14T．STAR与端粒酶活性多因素相关分析结果影响端粒酶活性的相关因素检验结果相关系数P值注：+不同指标之间比较，p<005有显著性差异：··p<001有非常显著性差异。aa第三军医大学硕士学位论文图lOT．STAR蛋白表达丰度与端粒酶活性的相关性图11T．STARmRNA相对嘉汰丰帝与端粘酶活件的相关十牛40aa第三军医大学硕士学位论文图12hTERT蛋白表达丰度与端粒酶活性的相关性图13hTERTmRNA相对表达丰度与端粒酶活性的相关性41aa第三军医大学硕士学位论文讨论一、卜STAR蛋白的表达T-STAR(testes-signaltransductionandactivatorofRNA,AF069681)是STAR(signaltransductionandactivatorofRNA)家族新成员，是一种细胞生长抑制蛋白【I】。由于结构上与另一STAR家族新成员Sam68(Src-associatedinmotosis．68KDa)蛋白非常相似，故又名SLM-2(Sam68一likemammalianprotein2，AF099092)例和Salpo(Sam68一likeproteinQ．AF051321)9】。近来GenBank又将其全名正式定为KHDRBS3(KHdomaincontaining，RNAbinding，signaltransductionassociated3)，以取代既往的Etle，SALP，SLM2，SLM．2，T．STAR，etoile等众多不同称呼。但由于以T．STAR为名的研究较早较多，己被大多数学者所接受，故本文仍延用此名称。T．STAR基因位于染色体8q24．2，其cDNA含9个外显子，长约1．2．1．9kb左右，其mRNA长约24kb，编码蛋白分子量在50．55KDa左右【4】。T．STAR在结构上与其它STAR家族成员，尤其与SAM68高度相似。有一个特征性的STAR功能域，该结构由一个Kn(hngNPKhomology)结构及其两侧的QUAl(Quakin91)和QUA2(Quakin92)序列组成。QUA2之后的C末端区有数个蛋白基序，包括聚脯氨酸序列(tyrosine-rish)，精氨酸．甘氨酸重复序列和富酪氨酸区(RASH功能域)pJ。STAR功能域又叫GSG(GRP33，Sam68，GI。D-1)结构或SGQ(Sam68／GLDl／Quaking)结构，是STAR家族成员的共同特征，为蛋白的RNA结合位点【11。其中的KH结构为具体的RNA结合域t6一～1。体外实验表明，通过蛋白．蛋白相互作用，T．STAR主要与RBM结构蛋白(如hnRNPG—T1和SH2／SH3结构蛋白发生特异结合【41。hnRNPG-T属RBM基因家族成员，是一种新的睾丸特异相关蛋白，是pre-mRNA剪接激活物，普遍表达于各种组织，但在睾丸中高表达。T．STAR与hnRNPG-T的相互作用说明T-STAR的功能与pre—mRNA剪接加工重要相关。研究表明，T．STAR作为酪氨酸蛋白，RNA结合蛋白，通过参与酪氨酸激酶信号转导系统p1和pre-mRNA的选择性剪接、加工【91等过程而参与了精子发生【11、细胞的增殖调节p1、永生化过程【10】及某些疾病的起病【1”。文献报道T．STARmRNA广泛分布于视网膜，胎肝，睾丸，前列腺，心脏，肺，胰腺，胎盘等组织中，在睾丸中表达最高，脑和骨胳肌其次，其它组织表达较弱口1。但aa第三军医大学硕士学位论文关于该蛋白在肿瘤组织的表达情况以及与正常组织表达情况进行比较的相关资料尚未见报道。Kool等【l0J认为T—STAR的表达水平在正常细胞，衰老前各期细胞中无明显差异，但在SV一40转化的永生化人成纤维细胞(VHl0／SV)中表达下调。另有研究者认为T—STAR的表达下调或缺失在由瘤基因转化介导的永生化过程中普遍存在，而不仅限于SV40转化的细胞永生化细胞中㈦。Lee和Burr等嘲认为T—STAR在脑和骨胳肌中呈较高表达，在胎盘、肝脏、肺脏等组织中呈低表达，可能是由于脑和骨胳肌中几乎没有分裂细胞的缘故。但该结论并不绝对，因为Venablcs等[11的研究表明T—STAR在增殖活跃的睾丸组织中呈高表达，他们进～步利用睾丸cDNA进行酵母菌双杂交筛选试验，发现T—STAR可与RBM(RNA—bindingmotif)蛋白(仅在有转录活性的雄性生殖细胞中表达的RNA结合蛋白)发生特异性结合，并能对后者表达起着调控作用，由此推测T—STAR参与了精子的发生。我们通过对不同肿瘤组织和相应正常组织的T—STAR蛋白表达情况(免疫组织化学和WesternB100和mRNA表达情况进行检测(RT-PCR)等多方面研究表明，①T—STAR广泛表达于肺，胃、肝、结肠、直肠等组织中；②T．STAR在肿瘤组织表达和正常组织表达之间存在显著差异，即主要表达于肿瘤组织中；③T—STAR在不同肿瘤组织中的表达也有较大差异，即在肺、胃、结肠和直肠的肿瘤组织中表达较高，总表达率为91．9％，尤其在胃癌和直肠癌中表达率均为100％，而在这些部位的正常组织中表达较少，总表达率仅为51-3％，且以弱阳性为主。T—STAR主要表达于增殖活跃的肿瘤组织中，提示该蛋白与肿瘤发生或维持之间存在某种联系。我们知道肿瘤细胞具有永生化特性，且恶性程度越高，永生化特性越强，我们的研究结果表明T—STAR与端粒酶活性呈正相关，这与我们的前期研究结果相符。已有研究表明T-STAR是重要的信号转导蛋白‘习和靶pre．mRNA的选择性剪接、加工[91调控蛋白，参与了细胞永生化过程并起重要作用，另外T—STAR在不同组织细胞中表达时的功能可能各不相同。但其中的具体调节途径和机制还不甚清楚。我们观察到，T—STAR蛋白主要表达于肺、胃、肝、结肠、直肠等组织(癌组织以及正常组织)的腺上皮细胞中，而在其它非腺体细胞中表达较少。与此一致的是，在收集到的3侧胃鳞癌组织标本中，无论是T—STAR的蛋白表达还是其mRNA表达，均检测不出或较弱，由于腺上皮细胞也属于增殖活跃组织，因此我们推测T—STAR不仅与肿瘤f主要是腺瘤)的发生有关，还与细胞的增殖调控有关，其中的具体机制也不清楚。我们还观察到，T—STAR蛋白在肝癌组织及正常肝组织的表达情况却正好与其它aaaa第三军医大学硕士学位论文组织的情况相反，几乎主要表达于正常肝组织中，而在肝癌中表达较少。由于肝脏本身即为增殖活跃的组织，且肝细胞不是腺体细胞，由此不难理解T—STAR在肝癌中表达并不比正常肝组织高。同时，我们还发现T—STAR既可表达于胞浆，也可表于胞核，但以胞浆表达为主。由于T—STAR的c端20个氨基酸残基所组成的NLS结构(T—STAR的C端约20个氨基酸残基)参与了蛋白的核内定位【11”】。而T—STAR的选择性剪接异构体，即Salp，与T—STAR相比，正好缺少富含酪氨酸的c末端13J。因此我们推测：T—STAR是以Salp为胞浆存在形式，且在细胞周期的大部分时间都位于胞浆中，当细胞处于特定细胞周期时，则移行于胞核内，并以Salp的形式存在；另外，作为酪氨酸激酶信号转导系统【习的重要一员和pre—mRNA的选择性剪接、加工【91调控物，T—STAR在胞浆和胞核中均发挥着重要作用，其中，在胞浆中可能以信号转导作用为主，而在胞核中则以参与靶pre—mRNA的选择性剪接、加工过程为主。二、hTERT的表达与端粒酶活性端粒是染色体末端由DNA重复序列及相关蛋白组成的末端融合保护装置【l41，有避免染色体末端融合，识别受损的DNA，维持染色体完整复制，参与核内染色体的功能组织，参与基因表达的调节，作为细胞衰老的分子钟调节细胞的复制能力等等。正常哺乳动物细胞的体外增殖次数是有限的，其最大极限叫“海弗利克极限”(Hayflicklimit)l”】。端粒会随细胞分裂次数的增加而逐渐缩短‘阚，当缩短到一定长度后启动某些信号，如细胞增殖调控基因等，使细胞停止分化并出现老化，即进入第一危机期(M1期)【”1：此时细胞若被病毒(SV40T抗原)转化，或某些抑癌基因(如P53，Rb等)发生突变，则可使细胞越过M1期继续分裂，端粒继续缩短，并最终进入第二危机期(M2期)【18】，此时染色体出现各种异常形态，细胞中某些端粒由于太短而失去功能，于是细胞死亡，但极少数细胞在此阶段激活了端粒酶，使端粒功能得以恢复，细胞越过M2期并获得永生化。端粒酶是一种RNA依赖性DNA聚合酶，为核糖核蛋白复合体，能催化复制端粒DNA重复序列，使端粒延长，是细胞无限增殖的分子基础，也是维持端粒稳定的重要因素【。端粒酶由RNA和蛋白质两部分构成。RNA组分包括模板区和一些附加序列，模扳区hTR(humantelomeraseRNA)的序列与端粒重复序列互补，是催化复制端粒DNA合成的模板㈣；蛋白质组分由多个亚单位组成，其中hTERT(humantelomerasereversetranscriptase)，是端粒酶的主要催化活性亚单位，对端粒酶活性起主要作用【2“221。aa第三军医大学硕士学位论文无论端粒酶活性有无，hTR均离表达于所有组织【\'”，且在癌细胞中的表达量高于正常细胞的5倍㈨。利用端粒酶RNA和hTERT可重构端粒酶活性【2526,271。正常人体细胞不表达端粒酶活性(除外生殖细胞、某些淋巴细胞、子宫内膜细胞和造血干细胞)【2829’301，但可检出端粒酶RNA表达，而hTERT难以检出；在一些人体细胞转染hTERT后可侵之出现端粒酶活性【31,321，而抑制肿瘤细胞中hTERT的表达则可抑制端粒酶活性‘33,34]。以上结论说明端粒酶活性与hTERT的表达有很好的一致性，可能是端粒酶活性的主要决定部份【”，因此目前hTERT的调控被认为是端粒酶活性调控的关键环节。我们用免疫组织化学和Westernblot两种方法对所有组织标本的hTERT蛋白表达进行检测，用半定量PT—PCR法对所有组织标本的hTERTmRNA表达进行了检测，均提示hTERT高表达于肿瘤组织中，在正常组织中几乎不表达。其中在肺癌的表达率为84．6％，在胃癌的表达率为90．9％，在肝癌的表达率为88．89％，在结肠癌的表达率为75％，在直肠癌的表达率为80％。文献报道hTERT在肺癌的表达率为89．O％p”，在胃癌的表达率为80．8％f泪，在肝癌的表达率为88．9％13”，在大肠癌的表达率为82．5％f38】，均与我们的结果相符。随后，我们又用PCR—ELISA法对全部肿瘤组织的端粒酶活性进行了检测，发现hTERT表达阳性的组织几乎都有端粒酶活性，相关性分析表明端粒酶活性与TERTmRNA表达水平和TERT蛋白表达水平相关，且均具有统计学差异(p0．05)。图3—2bA549系列细胞总蛋白电泳圈A：Marker；B：A549；C：A549·EGFP：D：A549·neo；E：A549-assTAR：F：A549-STAR3．RT—PCR半定量检测T—STARmRNA在A549系列细胞中的表达：从A549系列细胞中提取的总RNA琼脂糖凝胶电泳结果见图3．3a，从图中可见28s、18s、5s三条带，其中28s的亮度约为18s的2倍。核酸蛋白仪检测总RNA的浓度约为300ng／ml～800ng／ml之间，A260／A280为1．7·2．1之间。A549系列细胞的T—STARmRNA经逆转录成cDNA后，与B．actin同时行琼脂糖凝胶电泳，结果见图3-3b；对图3—3b中的各T—STARcDNA目的条带进行半定量分析，结果见表6。独立样本t检验分析表明，分别与对照组平均水平相比，T—STARmRNA表达水平在A549一STAR中增加有显著性差异(p<0．05)，在A549一asSTAR中下降有显著性差异(p‘O．05)，A549一STAR和A549一asSTAR组间比较有显著性差异(p‘O．01)，三种对照细胞组间比较无显著性差异(p>O．05)。91aa第三军医大学硕士学位论文图3．3bA549系列细胞的T—STARcDNA琼脂糖凝胶电图3．3a细胞总RNA琼泳，A：MarkerB：A549，C：A549一STAR，D：脂糖凝胶电泳A：A549-asSTAR中T—STAR正义链，E：A549一asSTAR中Marker；T．STAR反义链，F：A549一EGFP，G：A549-neo，冒鞲i期骥骥氅攀攀1。A：Mt}蠡蔷”B：A549，C：A549-STAR，D：A549．asSTAR，E：A549-EGFP，F：A549一neo．4．免疫组织化学检测hTERT蛋白在A549系列细胞中的表达：hTERT蛋白在各株细胞中均呈阳性表达，其中在A549一STAR中最强，在A549一asSTAR中表达较弱，见图3-4，且只表达于胞核。aa第三军医大学硕士学位论文5．Westernblot检测hTERT蛋白在A549系列细胞中的表达：hTERT蛋白在A549系列细胞株中均有表达，结果见图3．2b，从图中可见到，不同细胞总蛋白经电泳(图略)、电转移、免疫检测后，均在136KDa处出现一条清晰的特异性条带，hTERT蛋白的定量分析结果见表6。6．RT．PCR半定量检测hTERTmRNA在A549系列细胞中的表达：从A549系列细胞中提取的总RNA经琼糖凝胶电泳的结果与图3．3a相同(图略)，其中的hTERTmRNA经逆转录后，相应cDNA的琼糖凝胶电泳结果见图3-3c，A549系列细胞的hTERTmRNA相对定景表达水平见表6。7．A549系列细胞的端粒酶活性：各株细胞的端粒酶活性均呈阳性，PCR-ELISA定量检测结果见表6，从表中可见端粒酶活性在A549．STAR中相对较高，在A549．asSTAR中最低。8A549系列细胞中，不同指标表达的相互变化关系不同质粒转染的A549细胞中，T．STAR的蛋白定量、mRNA定量，TERT的蛋白定量、mRNA定量以及端粒酶活性测定值结果见表6和图3．5。从图表中可看出，①T—STAR的蛋白表达水平与其mRNA表达水平中呈同向平行变化，在A549-STAR中同时升高，在A549．asSTAR中同时降低；②hTERT的蛋白表达水平与端粒酶活性呈同向平行变化。③T．STAR与TERT表达在正、反义T-STAR基因转染的细胞中呈同向变化；④TERT蛋白表达的高低变化与端粒酶活性变化基本一致。⑤端粒酶活性与T．STAR表达呈同向变化。表6A549系列细胞中不同指标的定量值6±)T．STARhTERT．细胞株———————————————————————————————————————————————————一tolomeraseproteinmRNAproteinmRNAA5496922±0．323±5065±0．4220±2．687±A549．S眦19434±+1．28±+4427±O．5750±2．773±A549．ass嗽1122±++0．133±‘‘4158±++0．4143±2．004±‘’A549．EGFP8464±O．789±6610+O．4839±2．549±A549-neo6295±O．625±7218±0．5696±2．638±注：@protein定量值单位为INT×mm2，mRNA和端粒酶活性资料均无单位，为简便起见，表中省去各方差值a②与对照组平均水平比较，·表达升高有显著意义，p<0．05，··表达下降有显著意义，p0．05)。aa第三军医大学硕士学位论文6．RT-PCR半定量检测hTERTmRNA在SGC．7901系列细胞中的表达：从SGC-7901系列细胞中提取的总RNA经逆转录后，相应eDNA的琼糖凝胶电泳结果见图4-3b。SGC一7901系列细胞的hTERTmRNA相对表达水平见表7。独立样本t检验表明，与三种对照细胞平均水平相比，hTERTmRNA表达水平在SGC．STAR中增加有显著性差异(p<0．05)，在SGC—asSTAR中下降有显著性差异(po．05)。7．SGC．7901系列细胞的端粒酶活性：各株细胞的端粒酶活性均呈阳性，PCR-ELISA定量检测结果见表7，从表中可见端粒酶活性在SGC．STAR中最高，在SGC．asSTAR中最低，在其它细胞中差别不大。8．SGC．7901系列细胞中，不同指针表达的相互变化关系不同载体转染的SGC．7901细胞中，T．STAR的蛋白定量、mRNA定量，TERT的蛋白定量、mRNA定量以及端粒酶活性定量值结果见表7和图4-5。从图表中可看出，①T．STAR的蛋白表达水平与其mRNA表达水平呈同向平行变化，在SC,-C-STAR中同时升高，在SGC．asSTAg及对照细胞中均不表达：②hTERT的蛋白表达水平与其mRNA表达水平呈同向平行变化。③T．STAR表达与TERT表达在正、反义T．STAR基因转染的细胞中呈同向变化；④TERT蛋白表达的高低变化与端粒酶活性变化一致。⑤端粒酶活性随T．STAR蛋白表达下降而有所下降。表7SGC．7901系列细胞中不同指标的定量值6±)注；(i)protem定量值单位为INTXmm2，mRNA和端粒酶活性资料均无单位，为简便起见，表中省去各方差值。②与对照组平均水平比较，aaaa第三军医大学硕士学位论文+表达升高有显著意义tpO．05)。图5-2a：Westernblot检测T·STAR蛋自在HepG一2系，d纽胞中的表达A：HepG-2：B：HepG-STAR：C：HepG—asSTAR：D：HepG-EGFP：E：HepG—neo图5—2b；Westernblot检测hTERT蛋白在}碲，G一2系列细胞中的表达A：HepG—OeO；B：HeI：)G·EGFP：C：HepG-STAR：D：HepG-asSTAR：E：3．RT—PCR半定量检测T—STARmRNA在HepG一2系列细胞中的表达：从HepG．2系列细胞中提取的细胞总RNA琼脂糖凝胶电泳结果及浓度与A549细胞的情况相同(图略)。T—STARmRNA经逆转录成cDNA后，与B—actin同时行琼脂糖凝胶电泳，结果见图5—3a；对图5—3a中的目的条带进行半定量分析，结果见表8。对表中资料进行独立样本t检验，结果与T—STAR蛋白表达水平基本一致，即与三组对照细胞平均水平相比，T—STARmRNA表达水平在HepG—STAR中表达增加有显著性差异(p<0．05)，在HepG—asSTAR中表达下降有显著性差异(pO．05)。4．免疫组织化学检测hTERT蛋白在HepG一2系列细胞中的表达：HepG一2系列细胞均有hTERT蛋白表达，在HepG—STAR中最强，在HepG—assTARaa第三军医大学硕士学位论文相对较弱，在HepG—EGFP，HepG—neo和HepG一2中均有一定水平表达，见图5-4，且只表达于胞核。5．Westernblot检测hTERT蛋白在HepG一2系列细胞中的表达：HepG一2系列细胞均有hTERT蛋白表达，结果见图5—2b，阳性表达细胞总蛋白经电泳、电转移、免疫检测后，均在136KDa处出现一条清晰的特异性条带，hTERT蛋白的定量分析结果见表8。独立样本t检验表明，与三组对照细胞平均水平相比，hTERT蛋白表达水平在HepG—STAR中增加有显著性差异(pO．05)。6．RT—PCR半定量检测hTERTmRNA在HepG．2系列细胞中的表达：从HepG一2系列细胞的提取的细胞总RNA经逆转录后，相应hTERTcDNA的琼糖电泳结果见图5．2b。HepG一2系列细胞的hTERTmRNA相对表达水平见表8。独立样本t检验表明，与三组对照细胞平均水平相比，hTERTmRNA表达水平在HepG—STAR中增加有显著性意义(p‘0．05)，在HepG-asSTAR中下降有显著性意义(p<0．05)，在HepG—STAR和HepG—asSTAR组间比较有显著性差异(p‘0．01)，在三组对照细胞组间比较，相互无显著性差异(p，O．05)。7．HepG一2系列细胞的端粒酶活性：各株细胞的端粒酶活性均呈阳性，PCR—ELISA定量结果见表8，从表中可见端粒酶活性在HepG·2中最高，HepG-EGFP和HepG—neo其次，在HepG·asSTAR中最低。8．HepG一2系列细胞中，不同指针表达的相互变化关系不同载体转染的HepG一2细胞中，T—STAR的蛋白定量、mRNA定量，TERT的蛋白定量、mRNA定量以及端粒酶活性钡j定值结果见表8和图5—5。从图表中可看出，①T—STAR的蛋白表达水平与其mRNA表达水平呈同向平行变化，在HepG—STAR中同时升高，在HepG—asSTAR中同时降低；②TERT的蛋白表达水平与其RNA表达水平呈平行变化。⑧T—STAR表达与TERT的表达在正、反义T-STAR基因转染的细胞中呈同向变化；④TERT蛋白表达的高低变化与端粒酶活性变化一致。⑤T—STAR表达与端粒酶活性表达呈同向变化。aa第三军医大学硕士学位论文图5-2a；不同HepG．-2细胞的T-STAReDNA琼脂糖凝胶电泳A：Marker，B：HepG-2，C：HepG-STAR，D：HepG-asSTAR中T-STAR正义链，E：HepG-asSTAR中T-STAR反义链，F：HepG-EGFP，G：HepG-neo．图5-2bHepG-2系列细胞的h1薯】盯eDNA脂糖凝胶电泳，A：Marker，B：HepG-2，C：HepG-STAR，D：Hep6·asSTAR，E：HepG-EGFP，F：HepG-neo．101aa第三军医大学硕士学位论文表8HepG·2系列细胞中不同指标的表达6±)细胞株—————二±翌型坠———————————』里婆!———一telomer嚣eproteinmRNAproteinm]UqAHepG-24256±0．2252±2748±0．7810±3．177±H∞G．STAR9533±+1．1854士+3968±+0．9160±+2．451±HepG．∞STAR887±++0．1537±·+2281±++0．5310±++2．037±++H∞G-EGFP3738±0．425l±2581±0．6890±2945±HepG-neo4312±0．4396±3139±0．8710±2．879±注：0)protein定量值单位为IN\'TXmm2，mR．NA和端粒酶活性资料均无单位，为倚便起见，表中省去各方差值·②与对照组平均水平比较，·表达升高有显著意义．p锄05{··表达下降宵显着意义，p<005·图4-5SGC-7901系列细胞不同指标表达图图5-5HcpG-2系列细胞不同指标表达图102aa第三军医大学硕士学位论文六、正、反义卜STAR基因转染对结肠癌细胞株HOT-116细胞的影响1．免疫组织化学检测T．STAR蛋白在HCT．116系列细胞中的表达：T—STAR蛋白在HCT一116系列细胞中的表达情况与在A549和HepG一2细胞中的情况一致，见图6-1，即在HCT—STAR中高表达，在三种对照细胞(HCT．EGFP，HCT．neo和HCT一116)中等表达，在HCT—asSTAR中极低表达。说明HCT—STAR正确表达了外源T—STAR基因，而HCT—asSTAR中的T—STAR表达受到了一定程度的抑制，但未被完全抑制。2．Westernblot检测T．STAR蛋白在HCT—116系列细胞中的表达：T．STAR蛋白在HCT—116系列细胞株中均有表达，结果见图6—2a，不同细胞总蛋白经电泳、电转移、免疫检测后，均在55KDa处出现一条清晰的特异性条带，条带深浅顺序与免疫组织化学结果基本一致，即HCT—STAR最强，三种对照细胞(HCT—EGFP，HCT—neo和HCT一116)居中，HCT—asSTAR最弱。T-STAR蛋白的定量分析结果见表9。从表9中资料可计算出，与三种对照细胞的平均表达量相比，T．STAR蛋白在HCT—STAR中表达增加了63．58％，在HCT—asSTAR中表达量下降了71．32％。独立样本t检验表明，与对照细胞平均水平相比，T—STAR蛋白在HCT．STAR中表达升高有显著意义(p<0．05)，在HCT-asSTAR中表达下降有显著性意义(pco．05)，在HCT-STAR和HCT-asSTAR级藏比黩氯霉蔫矬差异(p‘o．01)，在三组对照细胞组间比较，相互无显著性差异(p>O．05)。图6．2aW∞temblm检测T．STAR蛋自在HCT·116幕列细胞申的表达A：HCT一116：B：HCT-STAR；C：HCT-asSTAR；D：HCT-EGFP：E：HCT—ne0图6．2bWesternblot检测hTERT蛋自在HCT-116系列细胞中的表达A：HCT—EGFP：B：HCT．STAR；C：HCT-nCO；D：HCT·116；E：HCT—asSTAR103aa第三军医大学硕士学位论文3．RT．PCR半定量检测T—STARm．RNA在HCT一116系列细胞中的表达：从HCT—116系列细胞中提取的总RNA的琼脂糖凝胶电泳结果浓度、纯度均与A549细胞和HepG一2细胞大致相同(略)。T—STARmRNA经逆转录成cDNA后，与B．aetin同时行琼脂糖凝胶电泳，结果见图6—3a，对图6—3a中的目的条带进行半定量分析，结果见表9。对表中资料进行独立样本t检验，结果与蛋白定量结果基本一致，即，与对照细胞平均水平相比，T—STARmRNA表达水平在HCT．STAR中升高有显著差异(p‘0．05)，在HCT—asSTAR中下降有显著性差异(p‘O．05)，在HCT—STAR和HCT—asSTAR组间比较有显著性差异(pO．05)。4．免疫组织化学检测hTERT蛋白在HCT．116系列细胞中的表达：HCT一116系列各株细胞均表达hTERT蛋白，见图6_4，在HCT-STAR中表达呈强阳性(4a)，在HCT—asSTAR呈较弱(4b)，几种对照细胞的表达差异不大，且只表达于胞核(4c)。5．Westernblot检测hTERT蛋白在HCT一116系列细胞中的表达：hTERT蛋白在HCT一“6系列各株细胞中均有表达，结果见图6—2b，不同细胞总蛋白经电泳、电转移、免疫检测后，均在136KDa处出现一条清晰的特异性条带。hTERT的定量分析结果见表9。对表中资辩进稽独蜜样本t检验袭臻，与三缀对照细胞平均水平相比，hTERT蛋白在HCT．STAR中表达增加有显著差异(p‘0．05)；在HCT．asSTAR中表达下降有显著差异(p‘O．05)：三组对照细胞组间比较无显著差异(p‘0．05)。6．RT—PCR半定量检测hTERTmRNA在HCT一116系列细胞中的表达：从HCT．116系列细胞提取的总RNA经逆转录后，相应eDNA的琼糖电泳结果见图6—3b。HCT—116系列细胞的hTERTmRNA相对表达水平见表9。对表中资料进行独立样本t检验，结果与hTERT蛋自表达情况基本一致，鞠簿慧种对熙细胞相比，hTERTmRNA在HCT—STAR中表达上升有显著差异(p‘O．05)i在HCT—asSTAR中表达下降有显著差异(pc0．05)；在三种对照细胞之间表达无显著差异(pcO．05)。aaaa第三军医大学硕士学位论文图6—3a不丽HcT一116细胞的T—STAReDNA琼脂糖凝胶电泳A：Marker，B：HCT-116，C：HCT—STAR，D：HCT．asST^R中T．STAR正义链，E：HcT．assTAR中T-STAR反义链，F：HCT-EGFP，G：I-IC\'f-neo，图6—3b不同HCT．116细胞的hTERTcDNA琼脂糖凝胶电泳A：Marker，B：HCT一116，C：HCT—STAR，D：HCT．asSTAR7．HCT—116系列细胞的端粒酶活性：HCT一116系列细胞的端粒酶活性均为阳性，PCR—ELISA定量结果见表9，从表中可见端粒酶活性在三组对照细胞中较高，在HCT—asSTAR中最低，而HCT—STAR介于中间。1Q5aa第三军医大学硕士学位论文8．HCT一116系列细胞中，不同指标表达的相互变化关系不同质粒转染的HCT一116细胞中，T—STAR的蛋白定量、mRNA定量，TERT的蛋白定量、mRNA定量以及端粒酶活性测定值结果见表9和图6-5。从图表中可看出，①T—STAR的蛋白表达水平与其mRNA表达水平呈同向平行变化，在HCT—STAR中同时升高，在HCT—asSTAR中同时降低；②hTERT的蛋白表达水平与其RNA表达水平呈平行变化。③T—STAR表达与TERT表达在正、反义T．STAR基因转染的细胞中呈同向平行变化；④T—STAR表达下降时，端粒酶活性也低。表9HCT-116系列细胞中不同指标的表达6±)注：(王)protein定量值单位为INTXmill2，mRNA和端粒酶活性资料均无单位，为简便起见，表中省去吾方差值。②与对照组平均水平比较，+pO05)。表ll各肿瘤细胞中不同指标的定量值压±S)注；①protei1定量值单位为INT×mm2，mR_NA和端粒酶活性资料均无单位·②与对照组平均水平比较，+p