荧光光谱分析讲义03,三维荧光光谱分析

('理解分子荧光分析的基本原理理解激发光谱发射光谱同步光谱三维荧光光谱的含义掌握分子荧光发射光谱的特性了解荧光光谱仪器的组成及各部分作用掌握影响荧光强度的内部结构因素和外部环境因素了解光谱分析法的应用范围第一章分子荧光光谱分析1概述分子荧光光谱分析也叫荧光分光光度法，是当前普遍使用并有发展前途的一种光谱分析技术。物质的分子吸收了紫外和可见光后它的电子跃迁到激发态，然后以热能的形式将这一部分能量释放出来，本身回复到基态。。如果吸收辐射能后处于电子激发态的分子以发射辐射的方式释放这一部分能量，再发射的波长可以同分子所吸收的波长相同也可以不同，这个现象叫光致发光，最常见的光致发光现象是荧光和磷光。当用一种波长的光照射某种物质时，这个物质会在极短的时间内发射出比照射波长更长的光，这种光称为荧光。对于荧光来说，当激发光停止照射后，发光过程几乎立即（10-9-10-6S）停止;当用一种波长的光照射某种物质时，这如果种物质在较长的时间内发射出比照射波长更长的光，这种光称为磷光。对于磷光来说，当激发光停止照射后，发光过程将持续一段时间（10-1-10S）;磷光和荧光的发光机理是不同的。由于物质分子结构不同，所吸收的光的波长和发射的荧光波长也有所不同，利用这个特性可以定性鉴别物质。同一种分子结构的物质用同一波长的激发光照射可以发射相同波长的荧光，若该物质的浓度不同，则浓度大时，所发射的荧光强度也强，利用这个性质可以进行定量测定。用荧光进行定性和定量的方法叫荧光分析法。2荧光分析的原理2.1分子荧光发生过程2.1.1荧光与磷光2.1.1.1分子的电子能级与激发过程分子除了电子不断运动外，分子本身还有振动和转动。量子力学表明，这些运动的能量是量子化的，所以分子有电子能级，分子振动能级，及分子转动能级。每个电子能级中有包含一系列的振动能级和转动能级。..图1分子电子能级，振动能级和转动能级示意图室温下大多数分子处于基态的最低振动能级。处于基态的分子吸收能量（电能，热能，光能，化学能）后被激发为激发态。激发态不稳定将很快衰变为基态，若返回到基态伴随着光子的辐射，这种现象称为发光。现在从分子结构上讨论荧光发光产生的机理。每个分子具有一系列严格分立的能级，称为电子能级。而每个电子能级中又包含者一系列振动能级和转动能级。我们用S0S1Sn表示电子的基态，第一电子激发的单线态和第N电子激发的单线态。T1表示第一电子激发的三线态。电子激发的单线态和相应的三线态的区别在于电子自旋方向不同，另外三线态的能级稍微低一些。电子能态的的多重性用M=2S+1表示,S为电子自旋量子数的代数和，其数值为0或1。大多数分子含有偶数个电子。基态时这些电子成对地填充在能量最低的各个轨道中。根据Pauli不相容原理,一个给定轨道中的两个电子，必定具有相反方向的自旋，即自旋量子数分别为1/2和-1/2，其总自旋量子数S=0，就是说基态没有净自旋。分子的多重度M=1，该分子体系便处于单线态，用符号S表示。大多数有机物分子的基态是处于单线态的。基态分子在吸收光能后其价电子从成键轨道或非成键轨道跃迁到高能量的反键轨道上，产生激发态分子，此为分子光吸收过程。但是激发态分子不稳定，通常很快失去能量回到基态。如果激发态分子在返回基态时以光辐射的形式失去能量，这种光辐射过程叫做光致发光。分子吸收能量后，如果电子在跃迁过程中不发生自旋方向的改变，这时分子处于激发的单线态。分子吸收能量后如果电子在跃迁过程中伴随自旋方向的改变，这时分子便具有两个自旋不配对的电子。即S=1，分子的多重度M=21+1=3，这时分子处于激发的三线态，用符号T表示。处于分立轨道上的非成对电子，平行自旋比成对自旋更稳定些（洪特规则）。因此三线态的能级总是比相应的单线态能级略低。单线基态激发单线态激发三线态图2单线态和三线态2.1.1.2荧光的产生根据波滋曼分布(Boltzmanndistribution)分子在室温时基本上处于电子能级的基态，当吸收了紫外可见光后，基态分子中的电子只能跃迁到激发单线态的各个不同振动-转动能级，根据自旋禁率,不能直接跃迁到激发三线态的振动-转动能级。处于激发态的分子是不稳定的，它可能通过辐射跃迁和无辐射跃迁等多种分子内去活化过程释放多余的能量而返回基态，发射荧光是其中途径之一。下面几种方式为基本去活化过程；振动弛豫：(VRvibrationalrelaxation)在溶液中的物质分子受入射光激发后形成的激发态分子，通过与溶剂分子碰撞，将部分能量传递给溶剂分子，其电子则返回同一电子激发态的最低振动能级。在这个过程中，分子被激发时吸收的能量不是以发出光辐射的形式耗散，因而属于无辐射跃迁。振动弛豫只能在同一电子能级进行，所需时间约为10-8秒数量级。内转换：(ICInternalconversion):指相同多重态电子能级中等能级间的一种无辐射跃迁过程。当两个电子激发态之间能量相差较小，以至其振动能级有重叠时，则可能发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转移到低电子能级的激发态。上述的振动能级之间很接近时，内部能量转换容易发生。外转换（Ecexternalconversion）：溶液中激发态分子与溶剂分子及其他溶质分子之间发生碰撞而消耗能量，所消耗的能量转换为热能。外转换常发生在第一激发单线态或第一激发三线态的最低振动能级向基态转换的过程中。转换时间为10-9---10-7秒，其发生可以降低荧光强度，这一现象叫荧光熄灭或猝灭。系间跨越(Intersystemcrossing,ISC)：系间跨越指不同多重度状态之间的一种无辐射跃迁过程。它涉及到受激电子自旋状态的改变S1\uf0aeT1，使原来两个自旋配对的两个电子不再配对，这种跃迁是禁阻的，但如果两个电子的能级的振动能级有较大的重叠时，例如激发单线态S1的最低振动能级与激发三线态T1的较高振动能级重叠,则可能通过自旋-轨道耦合等作用使S1态转入T1态的某一振动能级.。系间跨越可以使荧光强度减弱或熄灭。荧光发射：（Fluorescenceemission）.当分子被激发到任意一个激发单线态，并通过内转换及振动弛豫返回到第一激发单线态的最低振动能级后，再以辐射形式发射光量子并返回到基态的各个不同的振动能级上，在这个过程中发射的光量子即称作荧光。由于从较高的激发态的振动能级返回到第一激发单线态的最低振动能级耗散了部分能量，荧光的能量小于激发光能量，所以发射荧光的波长比激发光的波长要长。发射荧光的过程约需10-9—10-7秒，电子返回到基态时可以停留在基态的任意振动能级上，因此得到的荧光谱线有时呈现几个互相靠近的峰。通过进一步振动弛豫，这些电子很快回到基态的最低振动能级。根据kasha规则，荧光多为S1\uf0aeS0跃迁。荧光产生的过程和条件：荧光物质产生荧光的过程可以分为4个步骤1处于基态最低振动能级的荧光物质分子受到紫外线的照射，吸收了和它所具有的特征频率相一致的光线，跃迁到第一电子激发态的各个振动能级；2被激发到第一电子激发态的各个振动能级的分子，通过无辐射跃迁，返回到第一电子激发态的最低振动能级；3返回到第一电子激发态的最低振动能级的分子继续降落到基态的各个不同振动能级，同时发射出相应的光量子，这就是荧光；4到达基态的各个不同振动能级的分子，再通过无辐射跃迁最后返回的基态的最低振动能级。磷光发射激发态分子通过振动弛豫下降到第一电子激发态的最低振动能级后，有可能经过体系间跨越转移到激发三线态的高振动能级上。从单线态到三线态的分子系间跨越跃迁发生后，接着发生快速的振动弛豫而达到三线态的最低振动能级上。分子在三线态的最低振动能级可以停留一段时间，然后发出光辐射跃迁至基态的各个振动能级，这种光辐射叫磷光。磷光与荧光的根本区别是荧光是由激发单线态最低振动能级至基态各振动能级间跃迁产生的。由于激发三线态的最低振动能级比激发单线态的最低振动能级能量低，故磷光辐射的能量比荧光更小，亦即磷光的波长比荧光更长。从紫外光照射到发射荧光的时间约为10–8秒～10–5秒，而发射磷光则更迟一些，约在照射后10–4秒～10秒。图2荧光的产生2.1.2分子荧光的激发光谱与发射光谱任何荧光化合物都有两个特征光谱：激发光谱和发射光谱，这是定性和定量分析的基本参数和依据。激发光谱：荧光是光致发光，因此必须选择合适的激发波长。这可由激发光谱曲线来确定。绘制激发光谱曲线时选择荧光的最大发射波长为测量波长，改变激发光的波长，测定荧光强度的变化。以激发光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，即可得到荧光化合物的激发光谱。激发光谱的形状与吸收光谱的形状极为相似，经校正后的真实激发光谱与吸收光谱不仅形状相同，而且波长位置也一样，这是因为物质分子吸收能量的过程就是激发过程。区别在于紫外吸收光谱测定对紫外光的的吸收度，而荧光激发光谱测定发射的荧光强度。发射光谱：简称荧光光谱。将激发光波长固定在最大激发波长处，然后扫描发射波长，测定不同发射波长处的荧光强度得到荧光发射光谱。图3是室温下蒽在环己烷溶液中荧光激发光谱和发射光谱。从图中可见在蒽的激发光谱中350nm激发峰处有几个小峰，这是由于吸收能量后由基态跃迁到第一电子激发态中各个不同振动能级引起的。在蒽的发射光谱中也有几个小峰，这是由于蒽分子从激发态中各个不同振动能级跃迁到基态中不同振动能级发射出的荧光量子的能量不同引起的。2.1.3荧光光谱的特征：2.1.3.1Stockes位移在溶液荧光光谱中观察到的荧光发射光波长总是大于激发光波长，Stockes1852年首先观察到这种波长移动现象，因而称之为Stockes位移。激发峰位和发射峰位的波长差称为Stockes位移，它表示分子回到基态之前，在激发态寿命期间的能量消耗。用公式表示如下：单位是cm-1Stockes位移=107(1/\uf06cex-1/\uf06cem)\uf06cex\uf06cem分别为校正后的最大激发波长和发射波长。Stockes位移说明在激发和发射之间存在着一定能量损失，激发态分子通过内转换和振动驰豫过程迅速到达第一激发单线态的最低振动能级，这是产生Stockes位移的主要原因。激发态分子与溶剂分子的碰撞也造成能量损失，加大了Stockes位移。2.1.3.2荧光发射光谱的形状与激发波长无关原因：荧光分子吸收了不同波长的激发光后可被激发到不同能级，然后通过振动弛豫和内部能量转换,最终都将回到第一激发单线态的最低振动能级，再发射荧光。因此荧光发射与荧光物质的分子发射到哪个能级无关，即与激发能量无关。一般说来，荧光发射光谱的形状与激发波长的选择无关，激发电子都是从电子第一激发态的最低振动能级返回到基态的各个振动能级，所以荧光发射光谱的形状与激发波长无关。2.1.3.3荧光光谱与激发光谱的镜像关系荧光物质的荧光发射光谱与激发光谱存在着近似的“镜像对称”关系。图3是蒽的荧光激发和发射光谱图.。蒽的荧光激发光谱左边灰色图谱有一个a峰它是由分子吸收光后能后从基态S0跃迁到第二电子激发态S2形成的。在高分辨率的荧光光谱图上可以观察到B0b1、b2、b3、b4、等小峰组成的一蔟，他们分别由是由分子吸收光能后从基态S0跃迁到第一电子激发态S1的各个振动能级形成的（见光谱图上方与之对应的能级示意图）。各小峰间波长递减值\uf044\uf06c与振动能级差\uf044\uf045有关，各个小峰的高度与跃迁几率有关（b1的跃迁几率最大，b0次之，b2、b3、b4依次递减。蒽的荧光发射光谱（右边黑色图谱）同样包含C0、C1、C2、C3、C4一蔟小峰,他们分别由分子从第一电子激发态S1的最低振动能级跃迁至基态S0的各个振动能级发出光辐射形成的。由于电子基态的振动能级分布与与激发态相似但不相同,b1峰与c1峰b2峰与c2峰都是以\uf06cb2为中心基本对称。再加上C0、C1、C2、等峰的高度也与跃迁几率有关，c1的跃迁几率最大，c0次之，c2、c3、c4依次递减.）因此形成了激发光谱和荧光发射光谱的对称镜像现象。2.2荧光与分子结构的关系荧光与分子结构的关系是一个比较重要问题，弄清他们之间的关系可以预示分子能否发生荧光，在什麽条件下发生荧光。这对研究分子荧光分析的应用很有意义。2.2.1荧光寿命与荧光效率荧光寿命与荧光效率是荧光物质重要的发光参数荧光寿命Fluorescencelifetime)：当除去激发光源后，分子的荧光强度降低到激发时最大荧光强度的1/e所需的时间称为荧光寿命。常用\uf074f。表示。当荧光物质受到一个极短的光脉冲激发后，它从激发态跃迁到基态的变化可用指数衰减规则表示：Ft=F0e-Kt.式中F0，，Ft分别是在激发开始t=0和激发后时间t的荧光强度，K是衰减常数。假定在时间t=\uf074f测得得荧光强度Ft为F0的1/e，即Ft=1/eF0，根据上述公式，1/eF0=F0e-K\uf074f，由此得到1/e=e-K\uf074fK\uf074f=1，K=1/\uf074f所以上述公式可以写成Ft=F0e-K\uf074f或者LnF0/Ft=t/\uf074f如果以LnF0/Ft对时间t作图，直线斜率即为1/\uf074f。由此可以计算出荧光寿命。利用分子荧光寿命的差别，可以进行荧光混合物的分析。荧光效率（FluorescenceEfficiency）：又称为荧光量子产率(Fluorescencequantumyield)；是指激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光的光子数之比，它表示物质发射荧光的能力。通常用下式表示\uf06af\uf06af=发射荧光的光子/吸收激发光的光子=Kf/(Kf+∑Ki)Kf荧光发射过程的速率常数，∑Ki为其他有关过程的速率常数之和。许多物质并不发射荧光，因为在激发态分子释放激发能的过程中除了荧光发射外，还有许多辐射和非辐射跃迁过程与之竞争。如果在受激分子回到基态过程中没有其它去活化过程与荧光发射过程进行竞争，那麽在这一段时间内，所有激发态分子都将以发射荧光的方式回到基态，这一体系的荧光效率等于1。事实上，任何物质的荧光效率不可能等于1，而是在0~1之间。例如一些被作为荧光标准物质的9-氨基口丫啶（在水中），为0.99；蒽在乙醇中为0.30;硫酸奎宁二水化合物（在0.5mol/l硫酸溶液中）为0.55。荧光效率低的物质即使有较强的紫外吸收，所吸收的能量都以无幅射跃迁形式释放，内转换外转换的速度很快，所以没有荧光发射。2.2.2分子结构与荧光的关系2.2.2.1物质分子产生荧光的条件物质分子产生荧光必须具备两个条件；1物质分子必须具有与照射的辐射频率相适应的吸收结构，才能吸收激发光；实验表明，分子结构中含有\uf070\uf0ae\uf070跃迁或n\uf0ae\uf070跃迁的化合物都有紫外可见吸收，但n\uf0ae\uf070跃迁引起的R带是弱吸收带，电子跃迁几率小，由此引起的荧光很弱。所以实际上只有分子结构中存在\uf070\uf0ae\uf070跃迁，也就是K带强吸收时才可能有荧光发生。2吸收了与其本身特征频率相同的能量后必须具有一定的荧光量子产率。2.2.2.2分子结构与荧光性质荧光通常发生在具有共轭双键体系的分子中。能产生荧光的分子都具有共轭双键和大\uf070键。长共轭结构绝大多数荧光物质都含有芳环或杂环，因为具有这些结构的分子具有长共轭的\uf070\uf0ae\uf070跃迁。\uf070电子的共轭程度越大，荧光强度越大，而荧光波长也将红移。如苯萘蕙三个化合物的共轭结构与所发射的荧光的关系如下：苯萘蕙\uf06cex205nm286356\uf06cem278321404\uf06af0.110.290.36除了芳香烃外，含有长共轭双键的的脂肪烃也可能有荧光，但这一类化合物的数目不多。维生素A是能够发射荧光的脂肪烃之一。分子的刚性和共平面性在同样的长共轭分子中，分子的刚性和共平面性越大，荧光效率越大，且荧光波长产生长移。例如，在相似的测定条件下，联苯和芴的荧光效率分别为0.18和1，芴的分子中亚甲基使其分子的刚性增加，两个苯环不能自由旋转，共轭电子的共平面性增加，使芴的荧光效率大大增加。导致两者的荧光性质有显著差别。联苯芴同样情况还有酚酞和荧光素。他们分子中共轭双健长度相同，但荧光素分子中多一个氧桥，使分子中三个环成一个平面，随着分子刚性和共平面性增加，\uf070电子的共轭程度增加，因而荧光素有很强烈的荧光，而酚酞的荧光则很弱。不发生荧光或发生较弱荧光的物质与金属离子形成配位化合物后，如果刚性和共平面性增强，那麽就可以发生荧光或荧光增强。如8-羟基喹啉是弱的荧光物质，与镁，铝离子形成配位化合物后，荧光就增强。8-羟基喹啉8-羟基喹啉镁配合物如果原来结构中共平面性较好，但分子中取代了较大的基团，由于位阻的原因使分子的共平面性下降，则荧光会减弱。例如：1-二甲氨基萘-8-磺酸盐的\uf06af=0。03，而2-二甲氨基萘-8-磺酸盐的\uf06af=0.75,这是因为二甲氨基与磺酸盐之间的位阻效应，使分子发生了扭转，两个环共平面性变差，结果荧光减弱。结构式结构式2-二甲氨基萘-8-磺酸钠1-二甲氨基萘-8-磺酸钠CH2NOHNOMg2+Mg2+NOHNOMg2+Mg2+NCH3CH3SO3NaSO3NaNCH3CH3\uf06af=0.75\uf06af=0.03对于顺反异构体，顺式分子的两个基团在同一侧，由于位阻效应使分子不能公平面而没有荧光。例如1，2二苯乙烯的反式异构体就有强烈荧光，而其顺式异构体就没有荧光发射。取代基效应荧光物质分子上的各种取代基对分子的荧光光谱和荧光强度都会产生很大的影响。取代基可以分为3类：第一类取代基为给电子基团：包括—OH、—OR、—NH2、—CN、—NR2等使荧光增强。这是因为产生了P—\uf070共轭作用，增强了\uf070电子的共轭程度，使最低激发三线态与基态之间的跃迁几率加大的缘故。第二类取代基为吸电子基团：如—COOH，—C=O，—NO2,—NO,—SH,—NHCOCH3,—Cl,—Br,—I，由于减弱了分子\uf070电子的共轭程度，从而减弱甚至猝灭荧光。第三类取代基：对电子的共轭作用较小对荧光影响不明显。如—R—SO3H，NH3。表1列出了部分取代基对苯的荧光效率和强度的影响.表1苯环取代基在乙醇溶液中的荧光相对强度化合物分子式荧光波长荧光相对强度苯C6H6270-31010甲苯C6H5CH3270-32017丙基苯C6H5C3H7270-32017氟代苯C6H5F270-32010氯代苯C6H5Cl275-3457溴代苯C6H5Br290-3805碘代苯C6H5I--0苯酚C6H5OH285-36518酚离子C6H5O+310-40010苯甲醚C6H5O-285-34520苯胺C6H5NH2310-40520苯胺离子C6H5NH3+--------0苯甲酸C6H5COOH310-3903苯基氰C6H5CN280-36020硝基苯C6H5NO2-------------0-------------------------------------------------------------------------------------------------------取代基位置对应光强度有影响。对芳烃而言，一般邻位对位取代基增强荧光。间位取代基抑制荧光（—CN例外）。当取代基存在使共轭增加时，取代基影响下降。当两个取代基共存，可能其中一个起主导作用。重原子取代基存在如I-则会使荧光减弱。这是因为重原子的存在，使荧光体的电子自旋-轨道耦合作用加强，S1\uf0aeT1间的跨越显著增强的缘故。2.3影响荧光强度的外部因素分子所处的外界环境如温度、溶剂、酸度、荧光猝灭剂等，都能影响荧光效率，甚至影响分子结构及立体构象，从而影响荧光光谱的的形状和强度。了解和利用这些因素的影响，有助于提高荧光分析的灵敏度和选择性。2.3.1温度温度对荧光强度影响敏感。在一般情况下，随着温度的升高，溶液中荧光物质的荧光效率和荧光强度将降低。因为当温度升高时分子运动速度加快，分子间碰撞几率增加，使无辐射跃迁增加，从而降低了荧光强度。例如荧光素钠的乙醇溶液在零度以下温度每下降10度，\uf06af增加3%，在零下80度时\uf06af接近1。2.3.2溶剂溶剂的影响分为一般溶剂效应和特殊溶剂效应。一般溶剂效应指溶剂的折射率和介电常数的影响。特殊溶剂效应指荧光体和溶剂分子之间的特殊化学作用，如氢健的形成和化合作用。一般溶剂效应是普遍的，而特殊溶剂效应则取决于溶剂和荧光体的化学结构.。特殊溶剂效应大于一般溶剂效应的影响。同一荧光物质在不同溶剂中，其荧光光谱形状和强度都有差别。一般情况下，荧光波长随溶剂的极性增大而红移，荧光强度增强。因为在极性溶剂中，\uf070\uf0ae\uf070跃迁所需的能量差\uf044E减少，而且跃迁几率增加，从而使紫外吸收波长和荧光波长均红移，荧光强度增大。溶剂粘度减少，分子碰撞机会增加使无辐射跃迁增加而荧光减弱，故荧光强度随溶液的黏度降低而减弱。一般温度上升，溶剂黏度变小，因此温度上升荧光强度下降。2.3.3溶液的pH当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的酸度对荧光物质分子的荧光强度有较大的影响。这是因为其分子结构和离子结构是不同的，它们的电子构型不同在不同的酸度条件下分子和离子之间的平衡发生改变，因此荧光强度发生改变。每一种荧光物质的分子都有其最适宜的发射荧光的存在形式，即最适宜的pH范围。在pH7-12的溶液中，苯胺以分子形式存在，会发生兰色荧光，但在pH〈2或〉13的溶液中苯胺以离子形式存在不发生荧光。金属离子与有机试剂形成的发光螯合物也受溶液pH值的影响。一方面pH值会影响螯合物的形成，另一方面也影响螯合物的组成，因而影响他们的荧光性质。例如镓与2，2’—二羟基偶氮苯在pH3-4的溶液中形成1：1的螯合物，能发射荧光。而在pH6-7的溶液中则形成非荧光性的1：2型螯合物。234溶液荧光的猝灭荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象叫荧光猝灭。能引起荧光强度降低的物质叫猝灭剂。荧光猝灭的形式：碰撞猝灭：是荧光猝灭的主要类型。处于激发单线态的荧光分子M与猝灭剂分子Q相碰撞，使荧光分子以无辐射跃迁的形式回到基态，产生猝灭作用。这一过程可以表示如下：碰撞猝灭M+h\uf06e\uf0aeM\uf0aeM+h\uf06e’(发生荧光)\uf0aeM(非辐射猝灭)\uf0aeM+Q（碰撞猝灭）静态猝灭：由于部分荧光物质分子M与猝灭剂分子Q生成了本身不发生荧光的的配位化合物而产生。这一过程往往还会引起溶液吸收光谱的改变。转入三线态猝灭：在荧光物质分子中，引入溴和碘后易发生体系间跨越，而转变为三线态。转变为三线态的分子在常温下不发光，他们在与其它分子碰撞中消耗能量而引起荧光猝灭。溶解氧引起的荧光猝灭：溶解氧的存在使荧光物质氧化，或者由于氧分子的顺磁性，促进了荧光物质激发态分子体系间跨越跃迁，使激发单线态的荧光分子转变至三线态，从而引起荧光熄灭。发生电子转移反应的荧光猝灭：某些猝灭剂分子与荧光物质分子相互作用发生了电子转移反应，引起荧光猝灭。如甲基蓝溶液的荧光被Fe2+离子猝灭就是这种情况。其他的I-、Br—、CNS-—、S2O32-等易给出电子的阴离子，对奎宁，罗丹明及荧光素钠的物质的荧光也会发生猝灭作用。荧光物质的自猝灭：在浓度较高的荧光物质溶液中往往会发生自猝灭现象。其原因是单线激发态的分子在发生荧光之前和未激发的荧光分子碰撞引起自熄灭，如蒽和苯。有些荧光物质分子在溶液浓度高时会形成二聚体或多聚体，使其吸收光谱发生变化，也引起溶液荧光强度的降低或消失。解决方法：稀释样品；标准加入法。Stop2.3.5散射光的干扰当一束平行光照射在液体样品上，大部分光线透过溶液，小部分由于光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同角度散射，这种光称为散射光。瑞利散射：当光子和物质分子发生弹性碰撞时，不发生能量交换，仅仅是光子的运动方向发生改变，这种散射叫瑞利散射光。其波长与入射光波长相同。拉曼散射：光子和物质分子发生非弹性碰撞时，在光子运动方向发生改变的同时，光子与物质分子发生能量交换。光子把部分能量转给物质分子后，在一定条件下，分子所获得的能量使得围绕其中某一健分布的电子云产生瞬时弹性变形，这时辐射能量暂时保留在变形的极化分子的一个虚态上。这个虚态并不存在常规电子能级图中，电子在那里只能保持10-15-10-14秒时间，随后回到其电子能态基态的不同振动能级上，发射出比入射波长长或稍短的光，称为拉曼光。散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入射光波长更长的拉曼光，因为一般同时产生的多条拉曼辐射线，可以复合成一个覆盖一定波长范围的较宽的带，如果这种辐射带正好和荧光辐射的波长相近，就会对荧光测定产生干扰。因此在荧光测定中必须采取措施避免这种干扰。选择适当的激发波长可以消除拉曼光的干扰。以硫酸奎宁为例。从图4可见无论选320nm或者350nm为激发光,荧光峰总是在448nm。分别在320nm和350nm激发光下测定空白溶剂的发射光谱，（这种情况下并没有发生荧光发射，得到的是拉曼散射光）。从图b可见，当激发波长为320nm时瑞利光波长是320nm，拉曼光波长是360nm，拉曼光对荧光无影响；。当激发波长为350nm时瑞利光波长是350nm，拉曼光波长是400nm，拉曼光对荧光有干扰，因而影响测定结果。图4硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱水，乙醇，环己烷，四氯化碳，氯仿这5种溶剂是最常用的溶剂，他们自身都能发射拉曼散射光，从而可能干扰荧光测定。表2列出了不同波长激发光照射下的拉曼辐射波长，可供选择激发波长或溶剂时参考。表2不同波长激发光下主要溶剂的拉曼光波长溶剂激发波长248313365405436-------------------------------------------------------------------------------------------------------水271350416469511乙醇267344409459500环己烷267344408458499四氯化碳--320375418450氯仿--3464104615022.3.6内滤光作用和自吸收现象溶液中如果存在着能吸收激发或荧光物质所发射的光能的物质，就会使荧光减弱，这种现象称为“内滤光作用“。例如在1ng/ml的色氨酸溶液中如果有重铬酸钾存在，由于在色氨酸的激发和发射峰附近正好是重铬酸钾的两个吸收峰，吸收了色氨酸的激发能和色氨酸发射的荧光，使测得的色氨酸荧光大大降低。内滤光作用的另一种情况是荧光物质的荧光发射光谱短波长一端与与该物质的吸收光谱的长波长的一端有重叠。在溶液浓度较大时一部分荧光发射被自身吸收，产生所谓自吸收现象，降低了溶液的荧光强度。3定量分析方法3.1强度与浓度的关系由于荧光物质是在吸收光能被激发之后才发射荧光的，因此溶液的荧光强度与该溶液中荧光物质吸收光能的程度以及荧光效率有关。溶液中荧光物质被入射光（I0）激发后可以在溶液的各个方向观察荧光强度（F）。.但由于激发光有部分透过（I），这部分透过的入射光会干扰对荧光的测定，因此应该在与激发光源垂直的方向进行测定。设溶液中荧光物质的浓度为C，液层厚度为L，荧光强度F正比于被荧光物质吸收的光强度，即：F\uf0b5(I0—It)，F\uf0b5IaF=K’Ia,公式中K’为常数,其数值取决于荧光效率。根据Lambert–Beer定律Ia=I0—It=I0(1—10-ECL)=I0(1—e-2.3ECL)e-2.3ECL=1+(-2.3ECL)1/1!+(-2.3ECL)2/2!+(-2.3ECL)3/3!+(-2.3ECL)4/4!+……..若浓度很小，ECL值也很小，ECL<0.05时，式中第二项以后的各项可以省略，于是e-2.3ECL=1—2.3ECLF=K’Ia=K’I0(1—e-2.3ECL)=2.3K’I0ECL当入射光光强度和液层厚度一定，上式简写为F=KC在低浓度时溶液的荧光强度与溶液中荧光物质的浓度呈线性关系。荧光分析方法定量的依据是荧光强度与荧光物质的浓度的线性关系，而荧光强度的灵敏度取决于检测器的灵敏度，即只要改进光电倍增管和放大系统使极弱的荧光也能被检测到，可以测定很稀的溶液的浓度，因此荧光分析法的灵敏度很高。3.2定量分析方法标准曲线法：浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标绘制工作曲线，在同样实验条件下测定样品溶液。在绘制工作曲线时常采用系列中某一个标准溶液作为基准，将空白溶液的荧光强度读数调到0%将该标准溶液的荧光强度调到100%或50%。在实际工作中当仪器调零之后先测定空白溶液的荧光强度，然后再测定标准溶液的荧光强度,从后者减去前者即可,然后绘制标准曲线。为了使在不同时间所绘制的标准曲线能够一致，在每次绘制曲线时均采用同一个标准溶液对仪器进行校正。如果试样在紫外光下不稳定，可以改用另一种稳定的标准溶液作为基准，只要其荧光峰和试样溶液的荧光峰相近似，例如测定维生素B1时，可采用硫酸奎宁作为基准。在使用工曲线法定量时须注意荧光分析所用的试剂标准品一定要纯，样品池要清洁。被分析的样品不能用激发光长时间照射，以免荧光物质发生分解。标准溶液样品溶液应该在同一条件进行测定荧光强度。荧光猝灭法；在一般荧光分析方法中一些荧光猝灭剂应该事先分离。但也可以利用猝灭现象用于荧光分析。若某一物质本身不会发射荧光，也不与其他物质形成荧光物质，但他们会使另一种发射荧光的物质荧光强度下降，下降程度与该物质的浓度成比例，以次建立的荧光分析方法叫荧光猝灭法。例如氟离子会使铝-八羟基喹啉洛和物的荧光强度下降，在适当条件下荧光强度与氟离子的浓度成反比例，可用于痕量氟的测定。动力学荧光分析法化学反应时其中反应物或产物中有荧光物质，随着反应的进行，因为浓度变化引起荧光强度随时间的变化，可以求出物质的含量，以此建立动力学荧光分析法。例如Fe(III)pH=3.4时，1，4二氨基-2，3二氢蒽醌（A）与其发生氧化还原反应，产生深绿色荧光产物（B）,(\uf06cex=400nm,\uf06cem=470nm),反应式Fe(III)+H++AFe(II)+B当pH值一定时d[B]/dt=\uf068[A][Fe(III)]式中t为时间；\uf068为比例常数。在反应初期可以认为[A]不变，并对上式进行积分，则[B]=\uf068\uf0a2‘[Fe(III)]t又由于IFB=k[B]，公式中IFB为荧光物质的发射强度，则有IFB=\uf068\uf0b2[Fe(III)]t或IFB/t=\uf068\uf0b2[Fe(III)]通过测量不同[Fe(III)]下的标准系列浓度，由[Fe(III)]对IFB/t作图，得到工作曲线。如果有些化学反应的产物虽能够产生荧光但反应进行缓慢，而在加入某些微量金属离子的催化作用下，反应速率加快，荧光强度随之增强，那麽反应速率与该痕量金属离子浓度存在着定量关系，以此可以测量作为催化剂的痕量金属，此法成为催化荧光测定方法。直接比较法也叫比例法。如果荧光分析方法的标准曲线通过原点，就可以选择其线性范围，用比例法进行测定。取一个标准溶液使其浓度在线性范围内,测定其荧光强度Fs。之后在同样条件下测定试样溶液的荧光强度Fx，然后计算物质的含量。空白溶液的荧光强度调不到0%，必须从标准和试样的值扣除空白溶液的荧光强度F0，然后计算。Fs—F0=KCsFx—F0=KCx对于同一荧光物质，常数K相同（Fs—F0）/（Fx—F0）=Cs/CxCx=（Fx—F0）/（Fs—F0）Cx多分混合物分析.:如果不同组分的荧光光谱相互重叠可以考虑利用荧光强度的加合性质在适宜的波长处测定混合物的荧光强度，再根据被测各个组分的各自在适当的荧光波长处的荧光强度列联立方程求出各自含量。导数荧光光谱分析法也叫微分荧光光谱分析法，用物质荧光强度对对其荧光波长的导数值与其对应波长作图可得导数荧光光谱。dI/d\uf06c—\uf06c曲线一阶导数荧光光谱随着导数阶数的增加，荧光峰的尖锐程度增大，带宽减少，分辨率提高。将靠的很近的，重叠的荧光峰分别开来，还可以清楚地辨认陡坡上的弱小峰肩蜂，宽峰可以准确给出峰位。提供更多的结构信息，用于定性。用荧光导数值与样品浓度值呈线性关系可以用导数荧光光谱分析法定量。4荧光分析方法的特点灵敏度高与紫外可见分光光度法法比较,荧光是从与入射光成直角方向检测，即在黑背景下（有很小的噪声背景）检测荧光发射信号。所以可以用增强入射光强度或增大荧光放大倍数来提高灵敏度；在吸收光度法中不但要测定透过试样的光强度I，还要测量入射光强度I0.当试样浓度很低，吸收微弱，I和I0非常接近，检测器很难区分两个较大信号之间的微小差别。此外在分光光度法中如果增加入射光强度I0，I也按比例变化，若提高检测器信号的放大倍数，其放大作用I0和I是同样的。因此荧光分析的灵敏度要比分光光度法光高2-4个数量级。测定下限在0.1-0.001ng/ml之间。紫外可见分光光度法的灵敏度为10-7g/ml而荧光光度法测定的灵敏度在10-10–10-12g/ml之间。选择性好既可根据特征发射又可以根据特征吸收来鉴定物质。如果某几个物质的发射光谱相似，可以从其激发光谱的差异将其区分开来。而如果他们的吸收光谱相同，则使用发射光谱将其区分。所需样品量少，方法简便提供较多的物理参数可以提供激发光谱，发射光谱，荧光强度，荧光效率，荧光寿命，荧光偏振等参数，可以从不同角度反映荧光物质分子的各种特性，并通过这些物理参数得到被研究的物质的更多的信息。缺点应用范围不够广泛，本身能够发射荧光的物质较少，加入某种试剂经衍生化后才能测定的物质也不是很多。由于荧光分析的灵敏度高，测定时对环境因素敏感，干扰因素较多。如温度溶剂，酸度，散射光等。5荧光分析仪5．1仪器组成用于荧光测定的仪器由以下四个部件组成：激发光源；样品池，单色器，检测器（图5）。由光源发出的光经过第一单色器得到所需要的激发光波长，激发光通过样品池，荧光物质被激发后发射荧光。为了消除入射光和散射光的影响通常在与激发光垂直的方向上测定荧光。为了消除可能存在的其他光的干扰，如激发光产生的反射光，瑞利散射光和拉曼散射以及溶液中杂质产生的荧光，以便获得所需要的荧光，在样品池和检测器之间设置了第二个单色器，荧光作用于检测器上，记录相应的电信号。经过放大被记录下来。图5荧光光度计基本组成框图图6F-4500荧光光度计光路图激发光源在紫外可见光范围，常用的光源是高压氙灯和高压汞灯。氙灯内装有氙气，氙灯发射的光谱强度大，而且是连续光谱分布在200-700nm范围内，并且在300-400波长之间的强度几乎相等。目前大多数荧光计使用它作光源。高压氙灯是一种气体放电灯，外套为石英，内充氙气，室温下压力0.5Mpa(5atm)，工作时压力为2Mpa(20atm)。氙灯内充气总是处于高压状态先灯寿命约为2000小时，在安装或更换时要戴上防护镜或者严格按照操作规程进行以便防止以外发生。由于氙灯的启动电压在20-40KV，，不仅人体要注意安全，在仪器配有计算机是，应先点着氙灯带稳定后再开计算机。样品池液体样品池通常用石英材料制成，形状以方型或者长方形为好，因为这种形状散射光干扰较少。固体样品用可用样品架。单色器包括色散元件和狭缝。较高级的单色器采用光栅。其优点是在所有波长都能够色散而且色散均匀，有相同的分辨率。入射光的80%能量在一级光谱中。第一单色器用于选择所需要的激发波长第二单色器用于分离出荧光发射波长狭缝关系到单色器分辨率的优劣，用于控制谱带宽度和光强度。一般说来，狭缝越窄单色性越好。但光强随之减小而降低灵敏度。在实际使用时应该两者兼顾。检测器要求有较高的灵敏度，一般应用光电倍增管作检测器。5．2仪器的校正灵敏度校正荧光光度计的灵敏度可以用被检测出的最低信号来表示，通常以硫酸奎宁的检出限或者以纯水的的拉曼峰的信噪比（S/N）表示。荧光光度计的灵敏度与光源强度，单色器（包括透镜，反射镜）的性能，放大系统的特征，和光电倍增管的灵敏度有关；与所选用的波长，狭缝宽度有关。与被测空白溶剂的拉曼散射，激发光，杂质荧光有关。由于影响因素多，同一型号的仪器，甚至同一台仪器在不同时间操作，所测得的结果也不尽相同。因而在每次测定时，在选定波长和狭缝宽度的条件下，先用一种荧光性质稳定，浓度固定的标准液进行校正，将每次所测得的荧光强度调整到相同数值（50%或100%）。如果被测定的物质所产生的荧光很稳定，自身就可以作为标准溶液。紫外可见范围内最常用的是1\uf06dg/ml（0.05mol/l硫酸中）硫酸奎宁标准溶液。因为其产生的荧光十分稳定。波长校正荧光分光光度计的波长出厂前都经过了校正，若仪器的光学系统和检测器有所变动，或较长时间使用后，或在重要部件更换后，有必要用汞灯的标准谱线对单色器刻度重新校正，这一点在要求较高的测定工作中尤为重要。激发光谱和荧光光谱的校正荧光分光光度计所测得的激发光谱或荧光光谱往往随着仪器不同而不同。原因：单色器波长的准确度，拉曼散射光的影响，以及狭缝宽度等。其最主要的原因有光源的强度随波长变化，检测器对不同波长光的接受敏感程度不同，检测器的响应与光强不成线性。由于以上原因，在用单光束仪器测定激发和发射光谱时，因为不能用参比溶液进行相对校正，误差较大。尤其是当波长处于检测器灵敏度曲线的陡坡时得到的“表观光谱”中的值之间的相对关系不能反映真实情况，产生了显著误差。因此可先用仪器上附有的校正装置将每一个波长的光源强度调整到一致，然后根据表观光谱每一个波长的强度除以检测器对每一个波长的感应强度进行校正以消除误差。目前生产的光度计大都是双光束光路，可以用参比光束抵消误差。5.3荧光分析仪器的维护要正确提供主机及附件所需的供电电压和频率，不可接错电源。拿灯时不要碰窗口，如果不小心碰触，及时用无水乙醇擦净，灯源不稳定或强度太弱而影响测定时，应换灯；不要用肉眼直视灯源，以免损伤眼睛。单色器不得轻易拆卸，保持内部干燥，以防色散元件和反射镜受潮。放样品池时要固定一个方向，免得液池各透光面被池架的弹簧片擦坏，增加散射。液池要洗净，不得留有痕迹影响测定。新的液池常常挂水，可用3mol/l盐酸和50%乙醇等量混合液浸泡。保持光电倍增管室干燥，保证绝缘良好，光电倍增管通电后避免不必要的爆光要养成随时关闭光闸的习惯，以免损坏光电倍增管，或因为“疲劳”降低灵敏度。5.4荧光测定物理条件的选择荧光测定可变因素比较多，只有选好条件才能获得满意的激发和发射光谱。由于样品和仪器各不相同，因此测定条件不能固定不变。应当寻找仪器最佳条件灯电流光源灯电流不能超过测定范围，但为了提高测定灵敏度，可以调节灯电流到最大允许值。波长扫描范围：对已知光谱特性的样品，不需进行广泛扫描。在测试一个未知光谱特性的样品的激发和发射光谱时扫描样品时范围应该宽一些。如扫描发射光谱时，在短波方向应该多扫一些，以观测瑞利散射和喇曼散射的影响。狭缝宽度选好激发和发射单色器狭缝单色器宽度，是获得一个好图谱的关键。对定性分析来说，希望窄一些，因为狭缝窄谱带纯，能得到精细的光谱。对于定量测定狭缝小，光强弱，会影响测定的灵敏度和准确性，因而狭缝宽度不能过窄。样品池：进行精确分析时应该使用正方形池。微量池的优点是样品用量少和克服内滤光效应。缺点是狭缝宽度较大时池壁的散射和反射会进入发射单色器，使空白荧光增加。光电倍增管的电压：为了提高测定灵敏度，有时可以把光电倍增管的电压提高到最大允许值。但此时光电倍增管容易疲劳暗电流和噪音会因此增加。另外光电倍增管的灵敏度和波长响应与温度密切相关，因此温度较高时要注意散热。灵敏度：一般说来，灵敏度越高，所得的荧光强度越大，但仪器噪音和溶液的拉曼光也就越大。有时对于一个稀溶液，为了得到大的荧光强度以准确定量采用大缝宽和高灵敏度，但却会导致散射峰干扰，甚至掩盖了弱小荧光峰。扫描速度太快，响应不同步，容易漏掉小峰。6荧光分析新技术简单介绍6.1激光荧光分析激光荧光分析采用发射光强度大，波长更纯的激光作光源，该光源大大提高了荧光分析方法的灵敏度和选择性。利用激光光源的相干性可以产生非常理想的辐射，以激光为光源可以使仪器仅仅使用一个单色器，加上利用可调谐激光器的可调功能获取激发光谱发射光谱。目前，激光诱导荧光分析法已经成为分析超低浓度物质的灵敏而有效的方法。在分析单细胞核内元素时，最小可以测到10-16-10-14g6.2时间分辨荧光分析由于不同分子的荧光寿命不同，可以在激发和检测之间延缓一段时间，使具有不同荧光寿命的物质达到分别检测的目的。这就是时间分辨荧光分析。进行这种测量的具体做法是采用带有时间延迟设备的脉冲光源和和带有门控时间电路的检测器件，从而可对光谱重叠但寿命有差异的组分进行进行分辨和和分别测定。或者是固定发射波长，得到荧光强度随时间的衰变曲线和给定时间出的荧光发射光谱，可用于荧光寿命的测量，溶剂弛豫时间的测量。时间分辨荧光测定常用的光源是激光器，例如氩离子离子激光器可提供重复频率为76MHz，脉冲宽度为100ps的351nm激光光束。可调谐染料激光器还可以选择所需要的激发波长。在采用激光光源的时间分辨荧光计中由光束分裂器来的一部分激光，作为外触发信号，利用电子延迟电路选择控制一定延迟时间使盒式积分器门控开门，将样品发射并经光电倍增管放大后的信号输至盒式积分器获取信号。利用时间分辨荧光分析，如果选择了合适的延缓时间，可以把待测组分的荧光和其他组分或杂质的荧光以及仪器的噪音分开而不受干扰。该法在测定混合物中某一组分时的选择性比用化学法处理样品更好，而且省去前处理的麻烦。6.3同步荧光光谱分析同步荧光分析根据激发单色器和发射单色器在扫描过程中彼此间保持的关系，同步扫描荧光技术可分为固定波长差，固定能量差，和可变角同步扫描三类。固定波长差方法将激发和发射单色器波长维持一定的差值\uf044\uf06c，得到同步荧光光谱。这时如果\uf044\uf06c相当于或者大于斯托克额斯位移，能够获得尖而窄的荧光峰。荧光物质分子浓度与同步荧光光谱的峰高成线性响应关系。同步荧光光谱的荧光强度与激发光信号，荧光发射信号的关系为：当物质的浓度一定时，同步荧光信号强度与所用的激发光谱信号和荧光发射光谱信号的乘积成正比。Fsp(\uf06cem,\uf06cex)=KCFemFex.K为常数，C为待测物的浓度。所以此法灵敏度较高。固定波长差同步扫描中，\uf044\uf06c的选择直接影响到所得到同步荧光光谱的形状，带宽，和信号强度，从而提供一种提高选择性的途径。例如，铬氨酸和色氨酸的荧光激发光谱很相似，发射光谱又严重重叠，但\uf044\uf06c\uf03c15nm的同步光谱只显示铬氨酸的光谱特征，\uf044\uf06c\uf03e15nm的同步光谱只呈现色氨酸的光谱特征，从而可以实现分别测定。固定能量差同步扫描和可变角同步扫描技术可以进一步提高选择性和最大限度地减少瑞利散射和拉曼散射的干扰。同步扫描技术具有使光谱简化，使谱带变窄，提高分辨率减少光谱重叠提高选择性，减少散射光影响等优点。6.4三维光谱扫描三维光谱可以同时获得激发波长和发射波长同时变化的荧光强度信息。三维光谱有两种表现形式：等高线图和伪三维投影图。能够获得完整的光谱信息，是一种很有价值的光谱指纹技术，在临床中已经用语癌细胞的辅助诊断和不同细菌的表征和鉴别。另外作为一种快速检测技术，对化学反应的多组分动力学有独特的优点，目前采用三维光谱技术进行多组分混合物的定性定量是分析化学热点之一。图7-三维荧光光谱的两种表示6.5胶束增敏荧光分析胶束增敏是一种可以用来通过提高荧光效率，来提高荧光分析灵敏度的化学方法。20世纪40年代起人们就观察到胶束溶液对荧光物质有增溶，增敏，增稳作用，70年代后期人们将这种效应用于荧光分析，发展成为胶束增敏荧光分析法。胶束溶液是是具有一定浓度的表面活性剂溶液。表面活性剂的化学结构都具有一个极性的亲水基团和一个非极性的疏水基团。。在极性溶剂中（水）几十个表面活性剂分子聚合成团，将非极性的疏水基尾部靠在一起，形成疏水基向内，亲水基向外的胶束。溶液中胶束数量开始明显增加时的浓度，成为临界胶束浓度，低于临界胶束浓度溶液的表面活性剂分子基本以非缔合形式存在，超过临界浓度浓度后，再增加表面活性剂的量，非缔合分子的浓度增加很慢，而胶束数量的增加和表面活性剂浓度的增长基本呈正比。胶束溶液对荧光物质分子的增容作用是因为非极性的有机物与胶束的非极性尾部有亲合作用使荧光分子定位与胶束的脂性内核中这对荧光分子起到一定的保护作用，减弱了荧光质点之间的碰撞，减少了分子之间的无辐射跃迁，增加了荧光效率，从而增加了荧光强度。这就是胶束溶液对荧光的增敏作用。此外，胶束溶液提供了一种对激发单线态的保护性环境，荧光物质被分散和定域于胶束中，得到了了有效屏蔽，即降低了溶剂中可能存在的荧光猝灭剂的猝灭作用，也降低了因光物质因为自身浓度太大产生的自猝灭，从而延长了荧光物质的寿命。这就是胶束溶液对荧光的增稳作用。由于胶束溶液增稳和增敏作用，胶束溶液作为荧光介质可以大大荧光分析方法的灵敏度和稳定性，从而发展了分子荧光分析新技术。6.6荧光偏振（polarizer）及各向异性(anisotropy)测量在荧光光度计的激发和发射光路上分别加上起偏器和检偏器，即可仪对检偏器的取向平行或或垂直于起偏器的取向的情况下分别观察到荧光强度。。荧光偏振不仅与荧光体分子形状荧光物质吸光对偏振激发的取向，光选择性以及与激发矩和发射距是否为共线的共振偶极体有关，而且许多外界因素，如环境的黏度等都会影响和改变其偏振度，从而在生物化学领域获得广泛应用。例如已经用于确定生物分子间的缔合反应量，膜内微黏度膜组成对膜相变的影响。荧光体的偏振度与荧光体的转动速度成反比这一特性，可用于荧光免疫分析中。例如，当小分子荧光体被联结到大分子蛋白质或抗体后，由于体积变大，分子转动速度变慢，偏振度增大。若样品中存在小分子抗原，则连接于抗体上的荧光体可能被抗原夺走，结果偏振度下降，从而可用于抗原或抗体的测定。7应用7.1有机化合物的测定有机化合物中脂肪族化合物分子结构简单，能够产生荧光的为数不多。芳香族化合物及具有芳香结构的化合物，因为存在共轭体系而容易吸收光能在紫外光照射下很多能够发射荧光。能用荧光法测定的有机化合物包括多环胺类，萘酚类，嘌呤类，吲哚类，多环芳烃类具有芳环或芳杂环结构的氨基酸及蛋白质等；药物中的生物碱类如麦角碱麻黄硷，吗啡，喹啉类，异喹啉类生物碱等，抗生素类，青霉素四环素；维生素类如维生素A，B1,B2,B6,B12，E,抗坏血酸，叶酸，及烟酰胺等。此外中草药中的许多有效成分都能产生荧光，可以用荧光分析法进行初步鉴别和含量测定。20世纪50年代后期，分析工作者开发了许多适用于各种重要天然化合物荧光分析的衍生化方法。以下是几种重要的衍生化试剂。荧光胺能够与脂肪族或芳香族伯胺类形成荧光衍生物。邻苯二甲醛在二巯基乙醇存在下，在pH9-10的缓冲液中,邻苯二甲醛能与伯胺类除了半胱胺酸，脯氨酸，羟脯氨酸外的\uf061-氨基酸生成灵敏的荧光产物。丹酰氯可与伯胺仲胺及酚基生物碱类反应生成荧光产物。7.2无机物的荧光分析：无机离子中除了铀盐等少数离子外，一般不显荧光。一些反磁性的金属离子和有机的配体生成荧光螯合物可以成为分析这些金属离子的灵敏和选择性的方法。能用这种方法测定的金属离子有Al、Au、B、Be、Ca、Cd、Cu、Eu、,Ga、Gd、Ge、Hf、、Mg、Nb、Rh、Ru、Sb、Se、Si、Sn、Ta、Tb、Th、Te、W、Zn、Zr等。许多过渡金属离子不能够形成荧光化合物。应为这些金属离子是顺磁性的激发单线态上的电子容易发生向三线态的体系跨越。所以不易发生荧光。此外过渡金属离子形成的配合物，有许多靠得很近的能级容易发生内部能量转换而使分子失活，不大可能发射荧光。表3中列出了一些无机阳离子的测定方法。离子试剂\uf06cex\uf06cem干扰物Al桑色素pH3.3430500Fe,Th,UB二苯乙醇酮，pH12.8，乙醇中370480Be,SbBe桑色素，0.05MNaOH470-570CaCr,Li,Zn,稀土Ca钙黄绿素0.4MKOH360485Ba,SrCeCe(III)自身荧光0.6-2.9M高氯酸260365NO3Ga罗丹明B，苯萃取，6MHCl365橙黄Au,Fe,Sb,Ti,W,NO3Ge二苯乙醇酮，碱性乙醇中365黄绿As(V),B,Be,Cr(VI),NO2,SiO3Hf黄酮醇0.1M硫酸中365-400460Al,F-,Fe,PO4,ZrIn8-羟基喹啉，氯仿萃取pH5.1365535Al,Be,Cu,Fe,ZrLi8-羟基喹啉，弱碱性乙醇中370580MgMg8-羟基喹啉磺酸水溶液365Ca,Ru5-甲基-1，10菲咯啉，还原为Ru(III)后在pH6.0萃取465577AgCo,Cr(VI),Fe,Mn,(VI),PdSc水杨醛缩氨基脲，pH6.0370456在铜铁灵存在下采用磷酸三丁酯萃取消除干扰SnII7-氨基-3-硝基萘磺酸pH10.6365兰色Fe,Ti,U,V,联二硫酸根Sn桑色素，己烷中415-420495己烷或乙酸乙酯萃取Th桑色素，0.01MHCl，50%乙420520Al,Ca,Fe,La,Zr醇Ti罗丹明B，2MHCl，苯萃取360580Au,Fe,Ga,Hg,SbUVI浓磷酸或硫酸254黄绿Vv间苯二酚，10M硫酸360红Ce(IV)W（VI）罗丹明B,0.1MNaClpH2365570-640As,Au,Cr,F,Fe，Mo,PO4,TiVY8-羟基喹啉，氯仿萃取，pH9.5CeLaZn8-羟基喹啉，醋酸盐缓冲液420绿黄色Al,,Fe,,MgZr桑色素，2MHCl80%乙醇425515Al,Ga,Hf,Sb,Sc,Sn,Th,U阴离子的荧光测定涉及的反应有5种类型：氧化还原络合反应，生成离子对；酶反应；取代反应；复习思考题1解释名词：振动弛豫系间跨越量子产率，荧光猝灭，自猝灭，重原子效应内转换：外转换荧光发射：磷光发射激发光谱发射光谱：Stockes位移荧光寿命荧光效率2简述荧光光谱的特征3荧光光谱灵敏度高于吸收光谱的原因4分子结构如何影响荧光发射的5同步荧光光谱测量的基本方法及特点6比较荧光激发光谱，发射光谱和吸收光谱的异同7影响荧光分析的环境因素有那些？如何影响荧光测定的？8荧光分析的定量公式及公式的应用条件9简要说明时间分辨荧光分析可以消除背景荧光提高选择性的原理10解释斯托克位移发生的原因11荧光发射光谱的形状与激发波长无关的原因12荧光分析仪仪器组成及各个部分的作用13荧光分析方法的特点（优点缺点）14荧光测定物理条件（灯电流，波长扫描范围，狭缝宽度，光电倍增管的电压）的选择15简单介绍两种荧光分析新技术及特点',)