DNA提取方法及注意事项,dna提取过程及原理

('常用的CTAB法抽提叶片DNA1.称取适当重量的叶片组织于研钵中，加入适量石英砂和PVP,在液氮中将之研磨成细粉。2.将粉末快速转移至2mlEP管中，加入800μl预热的2%CTAB抽提缓冲液溶液，但总体积不应超过管容积的一半。3.65℃水浴60-90min，每隔5-10分钟颠倒混匀一次。取出冷却至室温后，加入等体积的氯仿-异戊醇（24：1），轻轻混匀。室温，12000g离心10min。4.转移上清液至一个新的2mlEP管中，记录其体积。加入1/10管体积的10％的CTAB溶液，轻轻混匀。加入等体积的氯仿-异戊醇（24：1），轻轻混匀。室温，12000g离心10min。5.用切掉尖端的枪头吸取上清，转移上清液至一个新的1.5mlEP管中，记录其体积。加入等体积的预冷的异丙醇或加入2倍体积的预冷无水乙醇，轻轻混匀，-20℃放置30min或过夜。6.4℃，10000g离心5min，弃上清，70%乙醇洗涤两次，风干，溶于适量体积的TE缓冲液中。所需试剂：1MTris-HCl（PH8.0）取121.1gTris碱溶于800ml蒸馏水，冷却后加入约42ml浓HCl调PH为8.0，定容至1L，高压灭菌。5MNaCl取292.2gNaCl溶于800ml蒸馏水，定容至1L，高压灭菌。0.5MEDTA（PH8.0）取186.1gEDTA-Na2.2H2O溶于800ml蒸馏水，加热搅拌溶解后加入约20gNaOH调PH为8.0，定容至1L，高压灭菌。2%CTAB(1L)CTAB20g2%1MTris（PH8.0）100ml100mM0.5MEDTA（PH8.0）40ml20mM5MNaCl280ml或81.8g1.4M定容至1L，现用现加入0.1-2%β-巯基乙醇10％CTAB（500ml）CTAB50g10%5MNaCl70ml0.7M定容至500ml1xTE（100ml）1MTris（PH8.0）1ml0.5MEDTA200μl定容至100ml高多糖和多酚含量类群的DNA提取方法I1..称取0.1-0.2g重量的叶片组织于研钵中，剪成小段并在液氮中将之研磨成细粉。2.将粉末快速转移至2mlEP管中，加入500μl预热的混匀缓冲液，混匀后加入100μl的5%十二烷基肌胺酸钠，100μl的10%PVP和100μl的20%CTAB,颠倒混匀。3.65℃水浴60-90min，每隔5-10分钟颠倒混匀一次。取出冷却至室温后，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇（25：24：1），轻轻混匀。4℃，3000g离心10min。4.转移上清液至一个新的2mlEP管中，记录其体积。加入等体积的预冷的异丙醇后再加入100μl的6MNaCl，混匀后-20℃放置至少1h。5.将絮状沉淀钩出置于一个新的1.5mlEP管中，70%乙醇洗涤两次，风干后溶于适量体积的TE缓冲液。所需试剂：混匀缓冲液(1L)CTAB20g2%Na2SO30.6g0.06%1MTris-HCl（PH8.0）200ml200mM0.5MEDTA（PH8.0）100ml50mM5MNaCl440ml或128.5g2.2M定容至1L酚-氯仿-异戊醇（25：24：1）6MNaCl10%PVP5%十二烷基肌胺酸钠(N-lauroyl-sarcosine)20%CTAB注：原文作者直接将剪成小段的叶片至于混匀缓冲液中，未经研磨；高多糖含量类群的DNA提取方法II1..称取0.1g左右重量的新鲜叶片组织于研钵中，剪成小段并在液氮中将之研磨成细粉（干燥材料适量减为四分之一）。2.将粉末快速转移至2mlEP管中，加入400μl预热的缓冲液І，颠倒混匀，室温，6800g离心15min。将上清液至一个新的2mlEP管中，记录其体积。加入等体积的氯仿-异戊醇（24：1），轻轻混匀1min。室温，3200g离心15min。3.转移上清液至一个新的2mlEP管中，记录其体积。加入二倍体积的预热2%CTAB提取液，65℃水浴60-90min（100rpm）。4.每隔5-10分钟颠倒混匀一次。取出冷却至室温后，加入等体积的氯仿-异戊醇（24：1），轻轻混匀。室温，3200g离心15min。5.转移上清液至一个新的1.5mlEP管中，记录其体积。加入1/30体积的3M的NaAC(PH5.2)和0.6倍体积的预冷的异丙醇，混匀，将絮状沉淀钩出置于一个新的1.5mlEP管中或者室温，3200g离心10min后弃上清。6.80%乙醇洗涤两次，风干后溶于500μl的1xTE缓冲液中。加入5μl的RNase（10mg/ml）37℃孵浴30min。7.加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），轻轻混匀。室温，3200g离心10min。8.转移上清液至一个新的1.5mlEP管中，加入二倍体积的预冷无水乙醇混匀后，室温，3200g离心10min。弃上清，80%乙醇洗涤两次，风干后溶于适量的超纯水中。所需试剂：缓冲液І:2%的十二烷基肌氨酸钠溶液和5MNaCl2%CTAB提取液3MNaAC(PH5.2)氯仿-异戊醇（24：1）注：材料在缓冲液І中一定要混合均匀，是本实验的关键，因为高浓度的NaCl和肌氨酸钠溶液被用来沉降多糖。高多糖含量类群的DNA提取方法III1-6.前同标准CTAB提取方法（略），溶于500μl的1xTE缓冲液后，加入5μl的RNase（10mg/ml）37℃孵浴45-60min。7.加入等体积的酚-氯仿-异戊醇（25：24：1），轻轻混匀。室温，5000g离心15min。转移上清液至一个新的2.0mlEP管中，记录其体积。加入500μl的5MNaCl和1ml的水饱和醚[加入NaCl和水饱和醚后成牛奶状]，颠倒混匀至透明后，室温，5000g离心10min。8.弃上层醚液，小心转移最底层液相至一个新的1.5mlEP管中，[吸取时，倾斜枪头以便形成狭缝便于吸取]，加入等体积的预冷异丙醇，混匀后-20℃放置30min。9.将絮状沉淀钩出置于一个新的1.5mlEP管中，70%乙醇洗涤两至三次，风干后溶于TE缓冲液中。注意事项：1.在核酸提取时，为增加细胞的裂解度和核蛋白复合体破碎度，在操作中常要用到溶菌酶和蛋白酶K，在确保没有核酸水解酶存在的前提下，酶反应时间越长越好。不确保核酸水解酶存在有无的前提下，可在溶菌酶使用时缓冲液中需加EDTA（因游离金属离子对酶有抑制）。蛋白酶缓冲液中用终浓度5mM的EDTA代替NaCL，并且可将反应温度提高到50－60℃，并将反应时间缩短到15－25min，但酶用量须提高10－20倍。2.对于富含酚的植物材料，细胞破碎时，在多酚氧化酶作用下，酚被氧化成有色的锟类物质，影响核酸的提取质量，可以在提取液中加入适量PVP和巯基乙醇以降低酚类的干扰（因PVP的“CO-N=”基团有很强的结合多酚化合物的能力，并随多酚化合物中芳环羟基数量增加而增加，但在PH8.0以上时结合能力会下降。巯基乙醇则可打断多酚氧化酶的二硫键使其失活另外作为还原剂的这些成分在一定程度上可抑制核酸水解酶的作用）。3.在提取核酸时还会遇到多糖的污染问题，具体表现为有机溶剂沉淀时，沉淀很多，但复溶时，大量沉淀不溶，电泳观察时核酸含量很低。克服多糖污染可采用以下一些办法（1）CTAB及氯仿-异戊醇(24:1)多次抽提。（2）在有机溶剂沉淀时选用异丙醇和5MNaCL作为沉淀溶剂时，NaCl用量可用到1/5-1/2的体积，异丙醇可用到0.6-1的体积。异丙醇沉淀核酸时，高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶液中，从而可达到去多糖的作用。但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作，因此须用乙醇多次洗涤脱盐。4．在核酸提取时，酚、氯仿和异戊醇均起到变性蛋白的作用。酚变性能力强于氯仿，但酚与水有一定的互溶，因此酚抽提后，除可能损失部分核酸外，水相中还会残留酚，而酚的存在将对核酸的酶反应产生强的抑制，因此在操作中可单用氯仿或单一酚作变性剂，也可用酚/氯仿或氯仿/异戊醇混合变性，但用单一酚变性后在有机溶剂沉淀时一定要用氯仿从抽提。5.为了保证核酸样品的完整性，操作要轻，尤其在提DNA时，更要避免剧烈操作。吸取液相时避免震荡分界面。6．风干时间不宜过长，以免DNA沉淀过干难于溶解。7．RNA污染，次生代谢物或者CTAB都会造成对DNA浓度的过高估计（大概3-5倍），估测浓度时应注意。',)