SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告

('分子生物学实验报告实验名称：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳班级：生工xxx姓名：xxx同组人：xxx学号：xxxx日期：xxxxSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1引言SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是目前分离蛋白质亚基并测定其分子量的常用方法，为检测电泳后凝胶中的蛋白质，一般使用考马斯亮蓝（CBB）染色[1]。本次实验的目的在于学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，并掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质的操作技术。2材料和方法2.1实验原理2.1.1聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理2.1.1.1性能聚丙烯酰胺凝胶的机械性能好，有弹性，透明，相对地化学稳定，对pH和温度变化比较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。通过改变浓度和交联度，可以控制孔径在广泛的范围内变动，并且制备凝胶的重复性好。由于纯度高和不溶性，因此还适于少量样品的制备，不致污染样品。2.1.1.2制备原理聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化系统有化学聚合和光聚合两种。本实验是用化学聚合。化学聚合的催化剂通常多采用过硫酸铵（AP）或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作加速剂，最有效的加速剂是N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）。在叔胺的催化下，由过硫酸铵形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合反应。叔胺要处于自由碱基状态下才有效，所以在低pH时，常会延长聚合时间；分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用；一些金属也能抑制聚合；冷却可以使聚合速度变慢。通常控制这些因素使聚合在1小时内完成，以便使凝胶的性质稳定。聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统，即只有分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不连续系统，不连续系统中最典型、国内外均广泛使用的是著名的Ornstein-Davis高pH碱性不连续系统，其浓缩胶丙烯酰胺浓度为4％，pH=6.8，分离胶的丙烯酰胺浓度为12.5％，pH=8.8。电极缓冲液的pH=8.3，用Tris、SDS和甘氨酸配制。配胶的缓冲液用Tris、SDS和HCl配制。1样品在电泳过程中首先通过浓缩胶，在进入分离胶前由于等速电泳现象而被浓缩。这是由于在电泳缓冲液中主要存在三种阴离子，Cl－、甘氨酸阴离子以及蛋白质－SDS复合物，在浓缩胶的pH值下，甘氨酸只有少量的电离，所以其电泳迁移率最小，而Cl－的电泳迁移率最大。在电场的作用下，Cl－最初的迁移速度最快，这样在Cl－后面形成低离子浓度区域，即低电导区，而低电导区会产生较高的电场强度，因此Cl－后面的离子在较高的电场强度作用下会加速移动。达到稳定状态后，Cl－和甘氨酸之间形成稳定移动的界面。而蛋白质－SDS复合物由于相对量较少，聚集在甘氨酸和Cl－的界面附近而被浓缩成很窄的区带（可以被浓缩三百倍），所以在浓缩胶中Cl－是快离子（前导离子），甘氨酸是慢离子（尾随离子）。当甘氨酸到达分离胶后，由于分离胶的pH值（通常pH=8.8）较大，甘氨酸离解度加大，电泳迁移速度变大超过蛋白质－SDS复合物，甘氨酸和Cl－的界面很快超过蛋白质－SDS复合物。这时蛋白质－SDS复合物在分离胶中以本身的电泳迁移速度进行电泳，向正极移动。由于蛋白质－SDS复合物在单位长度上带有相等的电荷，所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶，进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。溴酚蓝指示剂是一个较小的分子，可以自由通过凝胶孔径，所以它显示着电泳的前沿位置。当指示剂到达凝胶底部时，停止电泳，从平板中取出凝胶。在适当的染色液中（如通常使用的考马斯亮蓝）染色几个小时，而后过夜脱色。脱色液去除凝胶中未与蛋白结合的背底染料，这时就可以清晰地观察到凝胶中被染色的蛋白质区带。通常凝胶制备需要1～1.5小时，电泳在25～30mA下通常需要3小时，染色2～3小时，过夜脱色。通常使用的垂直平板电泳可以同时进行多个样品的电泳[2]。2.1.1.3凝胶浓度和交联度与孔径的关系凝胶浓度根据被分离的物质的分子量大小确定。当分析一个未知样品时，常先用7.5%的标准凝胶或用4~10%的凝胶梯度来试测，而后选出适宜的凝胶浓度。凝胶的机械性能、弹性是否适中很重要，胶太软易断裂，；太硬则脆，也易折断。2.1.2SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量的原理蛋白质分子在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于所带净电荷及分子的大小和形状等因素。如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS和巯基乙醇，2则蛋白质分子的迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。在蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原；SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS复合物。SDS与蛋白质的结合带来两个后果：第一，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，使所有的SDS-蛋白质复合物在电泳时都以同样的电荷／蛋白质比向正极移动；第二，SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。这两个原因使蛋白质-SDS复合物在凝胶电泳中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是蛋白质分子量的函数。选择一系列不同分子量的球形或基本呈球形的蛋白质作为标准物，使其形成SDS复合物。把这些复合物在相同条件下进行电泳分离，分子量小的物质泳动距离大，分子量大的物质泳动距离小。测定出相对泳动率，用相对泳动率对蛋白质的分子量的对数作图，它们在一定范围内呈直线关系。因此可作为标准曲线来检测样品蛋白质的分子量。2.1.3染色原理常用的染料主要有氨基黑10B、考马斯亮蓝R250、考马斯亮蓝G250、1-苯胺基-8-萘磺酸，各有优缺点，本实验选用考马斯亮蓝R250，它的染色灵敏度比氨基黑高5倍，尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色。2.2实验材料2.2.1试剂所用试剂有10%SDS、30%凝胶贮液（29%ACr-1%Bis）、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、10%过硫酸铵、TEMED、pH8.3Tris-Gly电极缓冲液、上样缓冲液、蛋白质Maker、0.25%考马斯亮兰R250染色液、甲醇：醋酸脱色液、异丙醇、tris-HCl（PH6.8）缓冲液、二硫苏糖醇、去离子水等。2.2.2器材所用器材有垂直板电泳槽、稳压稳流电泳仪、脱色摇床、50ml小烧杯、移液枪、枪头、玻璃棒、滤纸、表面皿、手套等。2.2实验方法2.2.1SDS聚丙烯酰胺的灌制按说明安装玻璃板，橡胶条放在两玻璃板之间，确定不漏液，玻璃板放入3电泳槽时，有凹槽的一侧向里，时刻保持玻璃片间的压力。根据表1制备分离胶溶液，加入TEMED后迅速旋转混合物，用1ml移液枪将其注入两块玻璃板之间的间隙中（灌制红色板的上边缘）。用枪在聚丙烯酰胺溶液上小心的覆盖一层异丙醇。将凝胶垂直放于室温下。（丙烯酰胺有神经毒性，故操作时应注意不要吸入其粉末，实验时应戴手套，剩余的聚丙烯酰胺溶液不要乱扔，待聚合后再处理）待聚合后（40min），倒掉覆盖层，用去离子水清洗凝胶顶部，尽可能倒掉凝胶上的液体，用滤纸吸干水分。按表1配置浓缩胶，加完TEMED后迅速旋转混合，注满玻璃板间隙，插入梳子（写有1.5mm的一侧向里，先插入一侧，在从一侧向另一侧压着插入，以排除气泡）将胶垂直放置于室温下。约30min聚合完成，拔出梳子（平行拔出），用去离子水冲洗胶孔，再用滤纸吸干水。取出玻璃板，取下橡胶条。表1分离胶与浓缩胶配制组分10%分离胶（ml）5%浓缩胶（ml）H204.02.730%丙烯酰胺3.30.671.5mol/LTris（PH8.8）2.5-1mol/LTris(PH6.8)-0.510%SDS0.10.0410%APS0.10.04TEMED(最后加)5μl3μl总体积1042.2.2电泳样品处理：将未加IPTG诱导的菌液37摄氏度摇至OD600=0.6-0.8左右，离心部分菌液分装，分别加入适量不含DTT与含DTT的上样缓冲液，其余菌液加至0.5mM浓度的IPTG20摄氏度进行诱导10h，分装菌液离心后分别加入适量不含DTT与含DTT的上样缓冲液。电泳槽中加入300ml电泳缓冲液，所有样品均需煮沸10min,然后用20μl加样枪依次加入IPTG诱导前的蛋白样品（20ul）、诱导前加DTT的（20ul）、诱导后样品（20ul）和诱导后加DTT的（20ul）、蛋白Maker，其余空加入等量4的上样缓冲液。盖好盖子连接电源（红接红，黑接黑），慢慢调节电压至90V，进行电泳，待指示剂达到分离胶，把电压加到150V，至指示剂的红色条带移除胶体，停止电泳。2.2.3染色、脱色将胶取出，并在右上角切个角，以标记顺序，放入培养皿中加入约40ml染色剂，放在摇床上染色1h，倒掉染色剂，先用清水洗几次，倒掉清水，再把胶放入脱色液中，脱色一天，每隔3h换一次脱色液,最后把胶取出来沥干水，拍照。3结果凝胶经脱色后观察结果，拍照得到的电泳条带如图2所示。其中5、6、7、8条带为本组样品条带，所对应的样品分别为：IPTG诱导前的蛋白质样品、诱导前加DTT的蛋白质样品、诱导后的蛋白质样品和诱导后加DTT的蛋白质样品。最左端的电泳条带所对应的样品为蛋白质Maker，条带9所对应的样品为缓冲液。图1为蛋白质Marker的电泳条带图示。4讨论4.1对实验结果的分析及结论5图1蛋白质Maker电泳条带图示图2SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果Maker1234567897、8条带和5、6条带相比，7、8条带的颜色更深。说明IPTG对蛋白质有诱导作用，能使蛋白质的构象发生变化，从而更易被染色。6、8条带和5、7条带相比,6、8条带中最上方的那条带颜色很浅，几乎没有。因为DTT可以将蛋白质中二硫键的还原，用于阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键。从而将大的蛋白质分子打断为若干小的蛋白质分子。所以最上方的条带颜色很浅，也间接证明了这条带中的蛋白质富含半胱氨酸等能形成二硫键的氨基酸。对比蛋白质Maker电泳条带图示，从蛋白质电泳条带的整体来看，样品中大部分蛋白质的分子量在18.4-116kDa之间。本次实验的电泳条带比较清晰，各条带对比明显，比较成功。4.2影响电泳分离的主要因素[2]4.2.1待分离生物大分子的性质待分离生物大分子所带的电荷、分子大小和性质都会对电泳有明显影响。一般来说，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。4.2.2电场强度电场强度（V/cm）是每厘米的电位降，也称电位梯度。电场强度越大，电泳速度越快。但增大电场强度会引起通过介质的电流强度增大，而造成电泳过程产生的热量增大。电流在介质中所做的功绝大部分都转换为热，因而引起介质温度升高，这会造成以下影响：①样品和缓冲离子扩散速度增加，引起样品分离带的加宽；②产生对流，引起待分离物的混合；③如果样品对热敏感，会引起蛋白变性；④引起介质粘度降低、电阻下降等等。电泳中产生的热通常是由中心向外周散发的，所以介质中心温度一般要高于外周，尤其是管状电泳，由此引起中央部分介质相对于外周部分粘度下降，摩擦系数减小，电泳迁移速度增大，由于中央部分的电泳速度比边缘快，所以电泳分离带通常呈弓型。降低电流强度，可以减小生热，但会延长电泳时间，引起待分离生物大分子扩散的增加而影响分离效果。所以电泳实验中要选择适当的电场强度，同时可以适当冷却降低温度以获得较好的分离效果。4.2.3缓冲液的性质缓冲液的pH值会影响待分离生物大分子的解离程度，从而对其带电性质产生影响溶液pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大，尤其对于蛋白质等两性分子，缓冲液pH还会影响到其电泳方向，6当缓冲液pH大于蛋白质分子的等电点，蛋白质分子带负电荷，其电泳的方向是指向正极。为了保持电泳过程中待分离生物大分子的电荷以及缓冲液pH值的稳定性，缓冲液通常要保持一定的离子强度，一般在0.02-0.2，离子强度过低，则缓冲能力差，但如果离子强度过高，会在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），由于离子氛与待分离分子的移动方向相反，它们之间产生了静电引力，因而引起电泳速度降低。另外缓冲液的粘度也会对电泳速度产生影响。4.2.4电渗液体在电场中，对于固体支持介质的相对移动，称为电渗现象。由于支持介质表面可能会存在一些带电基团，如滤纸表面通常有一些羧基，琼脂可能会含有一些硫酸基，而玻璃表面通常有Si-OH基团等等。这些基团电离后会使支持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的离子，在电场的作用下向电极方向移动，形成介质表面溶液的流动，这种现象就是电渗。在pH值高于3时，玻璃表面带负电，吸附溶液中的正电离子，引起玻璃表面附近溶液层带正电，在电场的作用下，向负极迁移，带动电极液产生向负极的电渗流。如果电渗方向与待分离分子电泳方向相同，则加快电泳速度；如果相反，则降低电泳速度。4.2.5支持介质的筛孔支持介质的筛孔大小对待分离生物大分子的电泳迁移速度有明显的影响。在筛孔大的介质中泳动速度快，反之，则泳动速度慢。4.3凝胶电泳蛋白质染色的其他方法除了本次实验用的考马斯亮兰染色法之外，实验室常用的凝胶电泳蛋白质染色的其他方法还有以下几种：4.3.1银染法[3]银染是迄今为止灵敏度最高的一种染色法。是对SDS-PAGE凝胶中的蛋白质进行染色时最常用的方法,其基本原理是银离子与蛋白质分子上的酸基(COO-)结合,然后银离子被还原为自由的银,可使蛋白质条带呈现深棕至黑色。银染基本上可以分为酸性和碱性2种方法。碱性方法非常敏感,但是需要较长的步骤。酸性方法快速但是灵敏度较低。银染的优点在于灵敏度高,其缺点在于:可能造成很高的背景,特别在水不够纯的情况下；费时费力(需要8～16h)；费用昂贵；需要接触有毒的甲醛,而且核酸、脂多糖、脂类、醣脂类化合物常会对银染染色的结果进行干扰。74.3.2荧光法[3]针对考马斯亮兰染色虽然快速但是灵敏度不够,银染法虽然灵敏度高但是背景较高,结果容易受到核酸污染等缺点,人们尝试用荧光染料对凝胶中的蛋白质条带进行染色。这些荧光染料有Fluoresceinisothiocyanate,dansylchloride,rhodamineisothiocyanate等。这些荧光染色方法需要在电泳之前荧光染料与一定的功能基团相结合。共价结合的荧光标签在蛋白质检测方面非常敏感,超过了考马斯亮兰。4.3.3负染法[3]负染的原理主要是有选择的将金属离子沉淀在胶上,蛋白质条带不能被染色,因此,它们所处的位置是透明的。这种方法非常简单快速。但是,这种方法的重复性依赖于许多物理化学因素(例如染色液的pH,胶中阴离子的浓度、温度等)。所以,它不能作为一种通常运用的方法。但是,与其他方法相比,该方法允许蛋白质保持完整并有效回收以做进一步的结构和生物学分析。特别是在运用咪唑锌进行负染时,凝胶中锌介导的蛋白质固定是完全可以逆转的,洗脱后的蛋白质没有受到化学修饰,也没有受到有机物的污染,咪唑锌或者改进后的咪唑-SDS-锌染色法灵敏度接近于银染（1-10ng）,重复性优于用铜或者锌进行的负染。4.4注意事项制备凝胶应选用高纯度的试剂，否则会影响凝胶聚合与电泳效果。由于与凝胶聚合有关的硅橡胶条、玻璃板表面不光滑洁净，在电泳时会造成凝胶板与玻璃板或硅橡胶条剥离，产生气泡或滑胶；拨胶时凝胶板易断裂，为防止此现象，所用器材均应严格的清洗。安装电泳槽和镶有长、短玻璃板的硅橡胶框时，位置要端正，均匀用力或用一旋紧固定螺丝，以免缓冲液渗漏。样品槽模板梳齿应平整光滑。用琼脂封底及灌凝胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的通过。凝胶完全聚合后，必须放置30min至1h，使其充分老化后才能轻轻取出样品模槽板，切勿破坏加样凹槽底部的平整，以免电泳后区带扭曲。为防止电泳后区带拖尾，样品中盐离子强度应尽量低，含盐量高的样品可用透析法或凝胶过滤法脱盐。最大加样量不得超过100μg蛋白／100μL℃。在不连续电泳体系中，预电泳只能在分离胶聚合后进行，洗净胶面后才能制备浓缩胶。浓缩胶制备后，不能进行预电泳，以充分利用浓缩胶的浓缩效应。电泳时，电泳仪与电泳槽间正、负极不能接错，以免样品反方向泳动，电泳时应选用合适的电流、电压，过高或者过低都会影响电泳效果。电泳后，应分别收集上下贮槽的电泳缓冲液，在冰箱贮存，可用2－3次。8为保证电泳结果满意，最好使用新稀释的缓冲液[2]。5参考文献[1]李文蓉,许键,喻梅辉.几种SDS-PAGE蛋白质染色方法的比较[J].八一农学院学报,1993,16(3):32-35.[2]分子生物学实验指导.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳.[3]常胜合,舒海燕,秦广雍,李宗伟,李宗义,王雁萍,杨天佑,陈林海.凝胶电泳蛋白质染色方法研究进展[J].河南农业科学,2006,(5):8-12.9',)