重组MIF腺病毒载体的构建、包装与纯化及其意义

('重组MIF腺病毒载体的构建、包装与纯化及其意义蓝海兵;罗亮;齐协飞;龚园其;陈玉【摘要】ObjectiveToconstructarecombinantadenovirusvectorcontaining(Macrophagemigrationinhibitoryfactor,MIF)andidentifythefunctionoftheAd-MIF.MethodsAmplifyMIFgeneplasmidwithmolecularbiologicaltechnique.IdentifythesuccessofMIFgeneplasmidamplificationwithgelelectrophoresis,sequencingandWesternBlottechnique.AmplifyMIFgenewithPCRtechnology,thenrecombinategenetoadenovirusvectorandpreparedforadenoviruspackaging.AmplifyvirusinHEK293cells,After3cyclesofamplification,thetiterofadenoviruscontainingMIFreachedanappropriatelevel.andTheproteinexpressedintheinfectedhumanairwaysmoothmusclecellssignificantlyincreased.ResultsItiscorrectwhenidentifytheMIFgeneplasmidusinggelelectrophoresis,sequencingandWesternBlottechnique.Thethevirustitrewas2E+9PFU/ml.ConclusionsThesuccessfulconstructionoftherecombinantadenoviruscontainingMIF,whichprovidesanexperimentalbasisforthebasicre-searchofMIFgenetherapyonasthma.%目的：采用分子生物学技术构建人巨噬细胞移动抑制因子（macrophagemigrationinhibitoryfactor，MIF）基因腺病毒表达载体，检测AD-MIF腺病毒转染人气道平滑肌细胞（airwaysmoothmusclecell，ASMC）后蛋白表达。方法用凝胶电泳、测序、Westernblotting等方法鉴定MIF质粒。用PCR技术扩增MIF基因，构建MIF-EGFP基因载体，重组到pAd腺病毒，转染HEK293细胞后扩增病毒，经3轮扩增后病毒达到合适的滴度，Westernblotting检测到腺病毒感染的气道平滑肌细胞内MIF蛋白表达明显增高。结果凝胶电泳、测序和Westernblotting检测MIF基因分子量、序列以及蛋白表达正确，并且成功构建MIF腺病毒，病毒浓度达2E+9PFU/ml。结论成功构建MIF腺病毒，为MIF基因治疗支气管哮喘提供了实验基础。【期刊名称】《江西医药》【年(卷),期】2016(051)006【总页数】4页(P516-519)【关键词】巨噬细胞移动抑制因子;腺病毒载体;气道平滑肌;支气管哮喘【作者】蓝海兵;罗亮;齐协飞;龚园其;陈玉【作者单位】南昌大学第二附属医院综合ICU，南昌330006;中山大学第一附属医院MICU，广州510080;南昌大学第二附属医院综合ICU，南昌330006;南昌大学第二附属医院综合ICU，南昌330006;南昌大学第二附属医院综合ICU，南昌330006【正文语种】中文【中图分类】R346支气管哮喘（以下简称哮喘）是一种慢性气道炎症性疾病，以气道高反应为主要特征，本质是多种细胞和细胞因子共同参与的气道慢性变应性炎症［1］。相关研究表明，在哮喘复杂的细胞因子网络中，巨噬细胞移动抑制因子（macrophagemigrationinhibitoryfactor，MIF）起着关键作用。MIF是一种具有酶活性的细胞因子，因在体外能够抑制巨噬细胞无目的移动，从而提高局部巨噬细胞的浓度而得名［2］。MIF基因在人类组中定位于22号染色体（22q11.2），由3个外显子和2个内含子组成。MIF蛋白由115个氨基酸组成，其相对分子量约为12500。目前已成功克隆出小鼠和人的MIF基因，两基因片段长度均小于1kb，并且具有高度同源性。本研究旨在构建一种能够高表达MIF蛋白的重组腺病毒，为MIF靶向基因治疗奠定实验基础，并为防止哮喘气道重塑提供新的干预途径。1.1材料大肠杆菌E.coli克隆株DH5α和HEK293细胞株为本实验室保存。1kpDNAladderMarker购自Fermenta公司，250bpDNAladderMarker和引物合成购自捷瑞公司；In-Fusion？PCRCloningKit（639626）购自clontech公司；TRIzolreagent、Taqpolymerase、dNTP、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自Takara；Plasmid抽提试剂盒购自Promega公司。限制性内切酶购自NEB公司。1.2方法1.2.1总RNA的提取和逆转录取大鼠支气管组织，以液氮研磨的方式打破细胞，每50-100mg组织加1mlTrizol进行裂解；将裂解液转入EP管并室温下孵育5min；在上述EP管中，按每1mlTrizol加0.2ml氯仿，震荡混匀15s。室温下放置2-3min，12000g，4℃下离心15min；取上层水相置于新EP管，按每1mlTrizol加0.5ml异丙醇，室温下放置10min，12000g，4℃离心10min；弃上清，按每1mlTrizol加1ml75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g，4℃离心5min，弃上清；让沉淀的RNA室温下自然干燥；用Rnase-freewater溶解RNA沉淀。1.2.2逆转录成cDNA在Microtube中配制下列混合液：OligodTPrimer（50μM）1μl；dNTPMixture（10mM）1μl；模板5μg；RNase-FreedH2O补至总体积10μl。65℃保温5min后，冰上迅速冷却。在上述Microtube管中配制下列反转录反应液，总量为20μl：上述变性后反应液10μl；5×PrimeScriptIIBuffer4μl；RNaseInhibitor（40U/μl）0.5μl（20U；PrimeScriptIIRTase（200U/μl）1μl（200U）；RNaseFreedH2O补至总体积20μl。缓慢混匀。按下列条件进行反转录反应：42℃30min；95℃5min，冰上冷却。1.2.3MIF基因PCR扩增设计MIF基因引物，下游引物：AGGTCGACTCTAGAGGATCCCGCCACCATGCCTATGTTCATCGTG；下游引物：TCCTTGTAGTCCATACCAGCGAAGGTGGAACCGTTC。以逆转录的cDNA为模板。PCR反应体系如下：Template1μL；10×PCRbuffer5μL；25μMdNTP4μL：10μM上下游引物各1μL；TaqDNApolymerase1μL；PfuDNApolymerase0.5μL；ddH2O补至总体积50μL。反应条件：95℃预变性，5min；95℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸45s；72℃延伸10min；30cycles。1.0%琼脂糖凝胶电泳，鉴定PCR产物，凝胶分析系统观察并拍照。1.2.4质粒酶切、连接、基因测序取GV314质粒（CMV-MCS-3FLAG-SV40-EGFP），酶切位点：BamHI/AgeI。酶切体系：10×Buffer1μl；质粒5μl；酶0.5μl；加水补足10μl。混匀并短暂离心后，置于37℃温育1-3hr。未酶切的质粒作为对照，琼脂糖电泳鉴定酶切结果。连接体系：10×连接Buffer1μl；PCR产物（载体：片段=1：5），连接酶0.5μl；加水补足10μl。混匀并短暂离心后置于16℃连接过夜。设计引物：pDC315-F：ggtataagaggcgcgaccag；EGFP-N-R：CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG。PCR扩增条件：95℃预变性5min；95℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸1min；72℃延伸10min；30cycles。1.0%琼脂糖凝胶鉴定，阳性转化子PCR产物大小：997bp；阴性转化子PCR产物大小：654bp。阳性克隆测序及结果分析。1.2.5重组腺病毒设计两端带attb的引物，扩增MIF-EGFP基因。上游引物：ggtataagaggcgcgaccag；下游引物：gtctggatcgtctagcatcg，切胶回收并纯化，BP重组到pDC315载体，转化、摇菌、抽提质粒，然后再LR重组到pAd腺病毒载体，测序验证，筛选出正确的克隆。1.2.6腺病毒包装制备高浓度pAd-MIF，重组质粒pAd-MIFPacI线性化，37℃酶切过夜。采用酚/氯仿抽提法进行纯化、紫外分光光度计测定浓度。线性化质粒转染293A细胞，48h（约有80%病变出现）后收集细胞及培养基。反复冻融法释放病毒，收集上清获得初级病毒液，并再次扩增。最后采用终点稀释分析法测病毒滴度。2.1MIF质粒的构建与验证2.1.1MIF基因片段的获取以大鼠支气管组织RNA逆转录的cDNA为模板，按照1.2.3中方法进行MIF的PCR扩增。如图1所示，获得长度为389bp的PCR产物。凝胶回收、纯化后用于后续连接步骤。2.1.2重组质粒琼脂糖凝胶鉴定将上述纯化后的MIF片段和GV314质粒分别进行酶切、连接、转化、扩增并抽取，获得MIF重组质粒。采用1.0%琼脂糖凝胶在恒压条件下电泳，其中2为阴性对照（ddH2O），2为阴性对照（空载体自连对照组），3为阳性对照（GAPDH），4为Marker，5-12为提取的MIF转化子。如图所示，提取的8管质粒都符合预期PCR产物大小997bp。阴性对照PCR产物大小为654bp。2.1.3质粒测序结果我们挑取阳性克隆质粒进行测序，结果经Pubmed中Blast分析均提示结果符合MIF目的序列。图3为部分序列。2.2腺病毒的构建与病毒滴定同样，运用分子生物信息学方法将上述MIF重组酶切、连接到pAd腺病毒载体，按上述方法部分步骤使之线性化。线性化的重组腺病毒转染293A细胞，转染成功的细胞表达EGFP蛋白，荧光显微镜下呈现绿色荧光，普通光镜下见部分细胞出现病斑现象（见图4）。于96孔板运用梯度稀释法，严格按照病毒滴度检测说明书进行病毒浓缩液滴度测定，获得MIF病毒滴度为2E+9PFU/ml。2.3重组MIF腺病毒转染细胞后EGFP的表达种植ASMC细胞到6孔板（5X106/孔），培养过夜后，按MultiplicityOfInfection（MOI）=20进行病毒感染，感染上的细胞将表达EGFP蛋白，荧光显微镜下呈绿色荧光。感染48h后，分别在普通光镜和荧光显微镜下观察对照病毒和MIF病毒感染的细胞（图5）。结果提示在上述感染滴度下，腺病毒感染率高于90%。2.4重组MIF腺病毒转染细胞后MIF蛋白的表达分别采用MOI=20、30和40感染人ASMC细胞，48h后提取细胞总蛋白，westernblot方法检测MIF蛋白的表达水平。如图6所示，感染MIF病毒的细胞内MIF表达水平显著高于对照细胞；而MIF蛋白在阴性对照细胞和感染对照病毒的细胞中均有内源性表达，两对照组间表达量无明显差别。MIF可广泛表达于单核/巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、上皮细胞、内皮细胞和平滑肌细胞等［3-5］。不仅可以抑制巨噬细胞的移动、调节T细胞的生长和活化，在炎症反应中发挥调控作用，而且能够对抗糖皮质激素的免疫抑制作用和抗炎活性，与嗜酸粒细胞、气道反应性和粘液分泌密切相关［6，7］。目前研究表明，哮喘患者肺泡灌洗液、痰液和血清中MIF含量均明显增高，而在卵白蛋白诱导的哮喘模型鼠肺泡灌洗液及血清中MIF含量亦明显高于对照组［8］。MIF基因敲除大鼠对肺组织及肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、IL-13的含量明显低于对照组，提示MIF可能上调Th2优势性细胞因子，参与哮喘的发病机制；MIF的表达水平还与哮喘大鼠气道的反应性及粘液分泌水平相关［9］，提示MIF可能与哮喘患者的临床症状存在内在的联系。国内有研究显示，重组巨噬细胞移动抑制因子（rMIF）能显著促进人胚肺成纤维细胞（MRC-5）的增殖［10］，而成纤维细胞是参与气道重塑的重要细胞成分。因此，MIF与哮喘的发生、发展关系密切。目前MIF在支气管哮喘中的研究多通过鼠模型的构建，因病毒较容易侵入机体细胞，影响宿主基因的转录和翻译。因此病毒载体近年来受到较为广泛的应用。其中慢病毒是以HIV-1为基础发展起来的基因治疗载体，可以通过载体上携带的编码相应抗生素的片段，通过抗性筛选获得过表达或低表达的稳定细胞株，从而进行体内或体外实验。而该方法的缺点在于耗时长，且基因表达的时间有限，在多处传代过程中可能会丢失靶基因。腺病毒或腺相关病毒载体则可以快速作用于细胞或动物，并具较高的感染效率。因此，腺病毒载体系统是目前基因治疗中运用最广的病毒载体之一。我们通过分子克隆、重组技术构建了MIF表达载体和重组腺病毒，并通过腺病毒转染、westernblot方法验证了MIF蛋白的高表达，提示我们腺病毒载体的构建是成功的，从而为研究MIF作用于哮喘的基础机制和治疗前景提供了有力的技术支持和理论依据。【相关文献】［1］LemanskeRFJr，BusseWW.Asthma：Factorsunderlyinginception，exacerbation，anddiseaseprogression［J］.JAlleryClinImmunol，2006，117（2）：S456-461.［2］SunHW，BernhagenJ，BuealaR，LolisE.Crystalstructureat2.6-Aresolutionofhumanmacrophageinhibitoryfactor［J］.ProcNatlAcadSciUSA，1996，93（1）：5191-5196.［3］LueH，KleemannR，CalandraT，RogerT，BernhagenJ.Macrophagemigrationinhibitoryfactor（MIF）：mechanismsofactionandroleindisease［J］.MicrobesInfect，2002，4（4）：449-460.［4］NoelsH，BernhagenJ，WeberC.Macrophagemigrationinhibitoryfactor：anoncanonicalchemokineimportantinatherosclerosis［J］.TrendsCardiovascMed，2009，19（3）：76-86.［5］MitchellRA.MechanismsandeffectorsofMIF-dependentpromotionoftumourigenesis［J］.CellSignal，2004，16（1）：13-19.［6］ChoiS，KimHR，LengL，KangI，JorgensenWL，ChoCS，BucalaR，KimWU.RoleofmacrophagemigrationinhibitoryfactorintheregulatoryTcellresponseoftumor-bearingmice［J］.JImmunol，2012，189（8）：3905-3913.［7］FanH，KaoW，YangYH，GuR，HarrisJ，Fingerle-RowsonG，BucalaR，NgoD，BeaulieuE，MorandEF.Macrophagemigrationinhibitoryfactorinhibitstheantiinflammatoryeffectsofglucocorticoidsviaglucocorticoid-inducedleucinezipper［J］.ArthritisRheumatol，2014，66（8）：2059-2070.［8］YamaguchiE，NihihiraJ，ShimizuT，TakahashiT，KitashiroN，HizawaN，KamishimaK，KawakamiY［J］.ClinExpAllergy，2000，30（9）：1244-1249.［9］KobayashiM，NasuharaY，KamachiA，etal.Roleofmacrophagemigrationinhibitoryfactorinovalbumin-inducedairwayinflammationinrats［J］.EurRespirJ，2006，27（4）：726-734.［10］陈培芬，罗雅玲，赖文岩，刑晓雯，胡斯明.巨噬细胞移动抑制因子促进肺成纤维细胞增殖和胶原合成［J］.中国病理生理杂志，2009，25（4）：699-702.',)