病毒virus-protocol

('純化/採樣/保存/定量病毒的純化純化的病毒不僅為測定病毒的化學性狀所必須，在製造疫苗時亦須用純的病毒。一般說來，動物病毒之純化有其困難存在，因用來純化病毒的那些感染組織內病毒的含量常很少，因此問題在如何從那些有相似物理化學性質的大量材料裡將少量的病毒純化出來，並且在純化過程還須不損害到病毒的感染力(Infectivity)。如果病毒在其繁殖過程並沒有從細胞解離到細胞外的體液(或培養液)；則要純化病毒的第一步驟，即須先把細胞破壞，此可用某些消化酵素或化學藥劑，或者以超音波振盪(Ultrasonicvibration)，或迅速的凍結與融解，(Freezingandthawing)來破壞細胞。再用低速離心(1000Xg)把病毒粒子和細胞成分分開，因病毒粒子比絕大多數的細胞碎片小，在低速離心下，病毒仍存在於上清液，這些上清液隨之可高速離心(50,000～100,000Xg)，即可把病毒全濃縮沈澱下來，此病毒沈渣以培養液懸浮後再經一次低速、高速離心，即可將大部分的雜質(細1胞碎片等)除去，而得半純化的病毒粒子。一步純化1.層次比重離心法(Density-gradientcentrifugation)高速離心仍純化病毒最常用的一種技術，因大多數宿主物質均比病毒大或者小，而易由離心將之與病毒分開，沈降速率差異大的物質，可以變速離心法(Differentialcentrifugation)來分開，而沈降速率差異小的，則以層次比重離心法(Density-gradientcentrifugation)較佳。層次比重離心法是一種層析的方法，利用層次比重的溶液，將不同比重的東西經離心而分開，常用來製備層次比重液的物質有蔗糖(Sucrose)，甘油(Glycerol)，鹽類如氯化銫(Cesiumchloride)，氯化銣(Rubidiumchloride)，酒石酸鉀(Potassium2tartrate)等。沈降速率和物質的大小形態，比重以及離心力之大小和所用溶液之黏度比重等均有關係，如溶液的比重與要分離物質之比重相近的話，則經長時間離心分離的程度與物質之比重相關，如要分離之物質間比重相似，則其分離就與其大小與形態有關，利用這些性質來分離物質的方法就叫rate-zonalseparation，病毒通常是一種核酸蛋白，其比重常比宿主細胞之蛋白及脂肪為高，故二者之分離即利用其此比重不同，而病毒之核酸蛋白與宿主細胞之核酸蛋白的分離則是藉其大小和形態之差異。層次比重溶液：蔗糖為最常用來配此溶液的物質，因為它可高度溶於水，而且又極少對3病毒有損，常用的層次濃度是5～20%和5～60%，商業上的sucrose常含有植物核酸酵素，(Ribonuclease)，其經高速離心後，常沈澱成類似病毒的粒子，因此使用前，最好用活性炭(Charcoal)處理後才使用，(600～700mg/ml之蔗糖溶液每100ml和5～10gm之活性炭，溫火煮沸，趁熱以有活性炭墊之濾器過濾後供用)。Glycerol(甘油)，似蔗糖之濃度及離心方法可以有相似的效果，且由此分離之材料可直接供電子顯微鏡檢查用，商品之glycerol，純度亦高，其對蛋自質之安定性亦極少有損。酒石酸鉀(Potassiumtartrate)，檸檬酸鉀(Potassiumcitrate)，也可做成好的層次比重液，不過會有將某些病毒沉澱出來的副作用。鹼性金屬之鹵化物亦常用來作此層析比重液，其黏稠度比蔗糖、甘油者之，為其壞處，但它的好處，是有的病毒在其高濃度溶液內不安定。離心材料之添加及離心：最普通的方法是將病毒溶液以小吸管小心加在層次比重液之上面即可，離心後病毒層區(Zone)之大小與病毒溶液內病毒量有關，濃縮的病毒溶液可得較好的層區。離心須在4℃之高速離心機行之，時間之長短依病毒之不同而異，例如Tobaccomosaicvirus在1X3"離心管(由3、7、7、7和4ml之0，10%，20%，30%，40%Sucrose形成之層次比重液)以SpincoModelL之SW25.0rotor在24,000rpm約5小時即可，由離心後之層數目和層範圍的寬度(Numbersandwidthofthebands)大致可知病毒純化的程度。層次比重之製備：將不同濃度的溶液加入離心管內，形成層次比重，其添加方法有下列數種。A小漏管將之伸到離心管之管底而後將較低濃度之溶液加入，而後逐次將較4高濃度溶液加入，使輕者浮上來而形成層次比重。B.小吸管將管之開口向上彎曲，管口之內徑以1～2㎜為宜，將高濃度之溶液先加而後逐次將較低濃度溶液慢慢滴在高濃度者上面而形成層次比重。A和B法製成之層次比重，宜置隔夜，使其形成均勻之層次比重後使用。2.化學劑法：此法是靠病毒特殊的化學性質來純化病毒，常用的有fluorocarbones，此可大量的將宿主細胞的脂肪和蛋白移去，而得純化的病毒。病毒像其他蛋白質一樣，亦可用有機溶劑，如甲醇(Methanol)來沈澱而得濃縮之病毒。病毒亦有用硫酸銨(AmmoniumSulfate)來沈澱而濃縮者。3.層析法(Chromatography)利用離子交換物質(Ionexchangematerials，例如Dowex所作成之Column，當病毒物質通過此Column時，用漸增鹽濃度的緩衝液，可將病毒和細胞之核蛋白分開，而得相當高純度之病毒，有很多種病毒皆可用此法作進一步之純化。54.核酸反應：此為病毒純化之最後步驟，利用核酸將病毒與核酸分開，如DNA病毒則用RNase，RNA病毒則用DNase除去污染之核酸。上述的各種病毒純化步驟均曾成功的被用過，但不同病毒往往須應用不同的方法純化之，在純化過程中在每個步驟之後，最好抽檢一下病毒之感染力(Infectivity)，與所含蛋白量，愈純化的病毒，應是含愈高感染力，而較低之蛋白含量，有時亦可以電子顯微鏡來觀察其純度。一些構造較單純的病毒，在達足夠純化時會形成結晶，許多複雜的病毒，常在純度增加時降低了其穩定度(即感染力受影響)，此可加極少量血清蛋自，以維持適當的鹽濃度而避免之。病毒的採樣61.採取時間：病材之採取時機及操作，對病毒之分離成功與否有相當重要的關係。一般而言，病材應在疾病之急性期採取，若錯過時候，則病毒之被發現機會就大會減少。2.採取：病材之採取之器具及操作應極力避免污染，組織器官之間之交叉污染亦應避免，如腸內容污染到腦等。病材採取後，置於無菌容器中，標明後立即置於冰箱中。病材在輸送過程一直到接種於適當宿主止，其間接應保持在冷的狀態下。3.輸送：病材注入無菌試管或瓶內，再置於金屬容器中(或紙板)，以紙或棉花充塞其空隙，防震及吸收滲入之液狀，此容器再置於夠大的纖維板或塑膠容器中，其間，放置足夠的乾冰，乾冰之間塞入細鉋花、木屑、碎紙等，以填充乾冰間之空隙，保護其內之容器。如果不克使用乾冰時，品質優良，中性，且以緩衝生理食鹽水泡成之50%甘油，可資應用，但在螢光抗體檢查時，則不能使用甘油。4.儲存：病材最好保持於－70℃之下，某些病毒在－20℃～－25℃下保存時，其感染力在短時間內不致降低，但在－70℃之下，則可維持較長時間。如果使用乾冰時，則病材應置於火焰封口之安瓶內，以避免CO2影響病毒之活性，或可將病材置於螺旋蓋試管或瓶子內，再置於塑膠袋內，保存於乾冰中。7病毒的保存作有關病毒學方面之實驗，其病毒株保存的好壞，實關係著實驗的成效，近年來由於低溫保存技術上的進步，將病毒材料大量保存而定期作實驗仍可得一定病毒量已非難事，或是可以於不同時間取材保存而後才同時來測定病毒。對於保存之溫度及機器等之優劣點列表如下：病毒株之保存，應將最好條件下繼代所得之材料，保存於最好之條件下，保存時應有記錄簿做詳盡之記錄，記錄事項應包括：毒株之名稱毒株之來源（分讓之研究室名．毒株從何種材料上分離，繼代於何種動物，繼代數，有關該毒株分離狀況之參考文獻等。）8分讓年月日分讓之材料(如感染漿尿膜30%乳劑50%甘油食鹽水之感染小白鼠腦等。)分讓後在該實驗室繼代時之狀況，繼代者姓名，繼代數繼代採材後之保存方及保存數(Ampule數等)分讓他人時記錄其住址及年月日毒株之繼代應在仍存有充分材料及仍有充分感染力時行之。為保存病毒材料必須了解各種病毒之特性，而選擇適當之方法與適當之安定劑(Stabilizer)，通常病毒對低溫乾燥抵抗力較強，pH7.0～7.6(弱鹼性安定，對酸性，高溫抵抗力弱，又在蛋白濃度高之液體中比較安定)。病毒之定量50﹪終點計算法(50endpoint)﹪50﹪endpoint是一種病毒劑量的表示法，依據所接種之對象判定方法之不同，又可以用數種不同的表示法，如LD50(50﹪Lethaldose)即為可引起所接種之動物50﹪死亡的病毒數量，ID50(50﹪Infectiondoses)即可引起接種之動物50﹪受感染的病毒劑量，TCID50即可引起所接種之組織培養50﹪發生細胞變性之病毒劑量。1.)TCID50之計算(Reed-Muenchmethod)9要測定力價之病毒作10倍階段稀釋，每個稀釋接種8面(或管)的組織細胞，每面(管)接種量0.1ml，每天觀察有無CPE或Syneytium發生(二者為病毒發育之表徵)，連續觀察7～10天(或是觀察到病毒發育至最大限量為止)。其計算法如下表：由以上公式求得0.6加到僅高於50﹪感染率稀釋指數(此例中為10-3)得10-3.6<即為病毒作10-3.6稀釋後每0.1ml含1TCIP50，亦即該病毒之力價為10-3.6/0.1ml。2).ID50之計算ID50之計算與TCID50完全相同，但依接種動物或胚胎是否受感染而判定，感染與否之判定標準如家兔在接種豬瘟病毒之熱反應，雞胚胎接種新城雞瘟後血球凝集等。計算公式同TCID503).LD50之計算10計算方法與前兩者完全相同，惟其判定標準係以接種動物或胚胎是否斃死判定之。PlaqueMethod本法是基於一個病毒只能產生一個Plaque的原理來測定病毒之力價，亦即能應用於可在組織培養細胞產生Plaque的病毒定量。要測定的病毒作十倍稀釋後，各稀釋接種二面組織培養細胞(直徑6公分Petridish之每面接種0.4ml，容量3oz的培養瓶接種量以0.2ml為宜)，接種之細胞37℃一小時讓病毒吸著，隨後以含Agar和Neutralred之培養液重層(Agaroverlay)置室溫待Agar硬化之後，放回孵卵器，繼續3～5天後，計算Plaque數，病毒之力價即以Plaque-formingunits。Perml(PFU/ml)表示之病毒稀釋10-5.82後每ml含1PFU之病毒，亦即病毒力價為105.82PFU/ml。參考文獻：111.HessW.R.andDeTray，D.E.(1960)TheuseofleukocyteculturefordiagnosingAfricanswinefever(ASF)Bull.Epiz.Dis.afr.8,3l7.2.Malmquist,W.A.andHay，D.(1963)HemadsorptionandcytopathiceffectproducedbyAfricanswinefevervirusinswinebonemarrowandbuffycoatcultures.Amer.J.Vet.Res.24,450.3.Pan,I.C.,Hung,T.S.andHess,W.R.(1982)NewmethodofantibodydetectionbyindirectimmunoperoxidaseplaquestainingforserodiagnsisofAfricanswinefever.J,Clin.Microbil.16：650-655.4.YechieiBecker.1987.Developmentinveterinaryvirology;Africanswinefever.MartinusNijhoffPublishing,Boston.5.Wensvoort,G.,Terpstra,C.,Pol.J.M.A.,TerLaak.E.A.;Bloemrad,M.,DeKluyver,J.M.,Moonen,P.L.J.M.,Zetstra,T.,DeBoer,E.A.,Tibben,H.J.,DeJong,M.F.,Van\'tVelt,P.,Groenland,G.J.R.,VanGennep,J.A.Voets,M.T.,Verheuden,J.H.M.,andBraamskamip.J,(l991a).MysteryswinediseaseintheNetherlands:TheisolationofLelystadvirus.Vet.Q.13,121-1306.Komaniwa,H.,Fukusho,A.andShimizu,Y.1981.Micromethodforperformingtitrationandneutralizationtestofhogcholeravirususingestablishedporcinekidneystrain.Natl.Anim.Hith.Quart.,21,153-158.7.Kumagai,T.,T.Shimizu,S.Ikeda,andM.Matumoto.1961.Anewinvitromethod(END)fordetectionandmeasurementofhogcholeravirusanditsantibodybymeansofeffectofHCvirusonNewcastlediseasevirusinswinetissueculture.I.Establishmentofstandardprocedure.J.Immunol.87,245-256.8.Matumoto,M.,T.Kumagai.,T.Shimizu,andS.Ikeda.1961.Anewinvitromethod(END)fordetectionandmeasurementofhogcholeravirusanditsantibodybymeansofeffectofHCvirusonNewcastlediseasevirusinswinetissueculture.II.SomecharacteristicsofENDMethod.J.Immunol.87,257-268.9.Shimizu,T.etal,1964.Anewinvitromethod(END)fordetectionandmeasuermentofhogcholeravirusanditsantibodybymeansofeffectofHCvirusonNewcastlediseasevirusinswinetissueculture.III.ENDneutralizationtest.Arch.Ges.Virusforsch.14：215-226.10.S.S.Lai;W.C.Ho;T.S.Huang;S.K.WanandT.C,Lin.1978.AsimpleandrapidmicrotiterprocedureforENDMethodtodetermineHogCholeraantibodytiters.J.ChineseSoc.Vet.Sci.No.2：109-111.11.Afshar,A.,andG.C.Dualc.1986.ImmunoperoxidaseplaquestainingforthedetectionofPseudorabiesvirus.Can.J.Vet.Res.,50：118-119.12.Kumagi,T.,T,Shimizui,S.Ikeda,andM.Matumoto.1961.Anewinvirtomethod(END)fordetectionandmeasurementofhogcholeravirusanditsantibodybyeffectofHCvirusonNewcastlediseasevirusinswinetissueculture.I,Establishmentofstandardprocedure.J.Immumol.,87：245.13.Pan,I.C.,T.S.HuangandW.R.Hess.1982.NewmethodofantibodydetectionbyindirectimmunoperoxidaseplaquestainingforserodiagnosisofAfricanswinefever.J.ClinicalMicro.,16：650-655.14.TracyT.C.LinandRobertC.T.Lee.1981.AnoverallreportonthedevelopmentofahighlysafeandpotentlapinizedhogcholeravirusstrainforhogcholeracontrolinTaiwan.NSCSpec.Publ.5：1-44.15.Wensvoort,G.,Terpstra,C.,Pol,J.M.A.,TerLaak,E.A.Bloemrad,M.,DeKluyver,E.P.,Kragten,C.,VanBuiten.L.,DenBesten,A.,Wagenaar,F.,Broekhuusen,J.M.,Moonen,P.L.J.M.,Zetstra,T.,DeBoor,E.A.,Tibben,H.J.,DeJong,M.F.,Var\'tVelt,P.,Groenland,G.J.R.,VanGennep,J.A.Voets,M.T.,Verheuden,J.H.M.,andBraamaskamp.J.(1991a).MysteryswinediseaseintheNetherlands：TheisolationofLelystadvirus.Vet.Q.13,121-130.16.陳瑞英、周德源.1987.膠體電泳分析DNA片段.電泳分離技術研討會論文集研討會專集(九)：P87-91.17.Kawasaki,E.s.1990.SamplePreparationfromBlood,Cell,andotherfluids.In"PGRProtocal"(ed.byMichealA.Inni,DavidH.Gelfand,JohnJ.Sninsky,ThomasJWhite),P146-152.AcademicPress.Inc,SanDiego.18.Rusell.H.1989.SimpleandRapidPreparationofSamplesforPCR.In"PCRTechnology"(ed.byH.A.Erich),P31-38.StocktonPress,NewYork.1219.Higuchi,R.1989.Rapid,EfficientDNAExtractionforPCRfromCellsorBlood.Perkin/CetusNewsletterAmplifications2：1.20.Chomczniski,P.,andSacchi,N.1987.SigleStepMethodofRNAIsolationbyAcidGuanidiniumThiocyanate-Phenol-ChloroformExtraction.Anal.Biochem.162：156-159.21.Krug,M.andBerger,S.L.1987.First-strandcDNASynthesisPrimedwitholigo(dT).In"GuidetoMolecularCloningTechniques"(ed.byBerger,S.L.andKimmelA.R.),P316-325.AcademicPress,INc.SanDiego.22.Przybyla,A.E.andChirgwin,J.M.1987.IsolationofRNAusingQuanidiumSalts.In"GuidetoMolecularCloningTechniques"(ed.byBerger,S.L.andKimmelA.R.),P219-227.AcademicPress,INc,SanDiego.23.SambookJ.FritschE.F.,ManiatisT.InVitroAmplificationofDNAbythePolymeraseChainReaction.In"MolecularCloning：ALaboratoryManual,2ndedition(3vols)".Ch.14.ColdSpringHarborLaboratoryPress.来源：純化/採樣/保存/定量病毒的純化純化的病毒不僅為測定病毒的化學性狀所必須，在製造疫苗時亦須用純的病毒。一般說來，動物病毒之純化有其困難存在，因用來純化病毒的那些感染組織內病毒的含量常很少，因此問題在如何從那些有相似物理化學性質的大量材料裡將少量的病毒純化出來，並且在純化過程還須不損害到病毒的感染力(Infectivity)。如果病毒在其繁殖過程並沒有從細胞解離到細胞外的體液(或培養液)；則要純化病毒的第一步驟，即須先把細胞破壞，此可用某些消化酵素或13化學藥劑，或者以超音波振盪(Ultrasonicvibration)，或迅速的凍結與融解，(Freezingandthawing)來破壞細胞。再用低速離心(1000Xg)把病毒粒子和細胞成分分開，因病毒粒子比絕大多數的細胞碎片小，在低速離心下，病毒仍存在於上清液，這些上清液隨之可高速離心(50,000～100,000Xg)，即可把病毒全濃縮沈澱下來，此病毒沈渣以培養液懸浮後再經一次低速、高速離心，即可將大部分的雜質(細胞碎片等)除去，而得半純化的病毒粒子。進一步純化1.層次比重離心法(Density-gradientcentrifugation)高速離心仍純化病毒最常用的一種技術，因大多數宿主物質均比病毒大或者小，而易由離心將之與病毒分開，沈降速率差異大的物質，可以變速離心法(Differentialcentrifugation)來分開，而沈降速率差異小的，則以層次比重離心法(Density-gradientcentrifugation)較佳。層次比重離心法是一種層析的方法，利用層次14比重的溶液，將不同比重的東西經離心而分開，常用來製備層次比重液的物質有蔗糖(Sucrose)，甘油(Glycerol)，鹽類如氯化銫(Cesiumchloride)，氯化銣(Rubidiumchloride)，酒石酸鉀(Potassiumtartrate)等。沈降速率和物質的大小形態，比重以及離心力之大小和所用溶液之黏度比重等均有關係，如溶液的比重與要分離物質之比重相近的話，則經長時間離心分離的程度與物質之比重相關，如要分離之物質間比重相似，則其分離就與其大小與形態有關，利用這些性質來分離物質的方法就叫rate-zonalseparation，病毒通常是一種核酸蛋白，其比重常比宿主細胞之蛋白及脂肪為高，故二者之分離即利用其此比重不同，而病毒之核酸蛋白與宿主細胞之核酸蛋白的分離則是藉其大小和形態之差異。15層次比重溶液：蔗糖為最常用來配此溶液的物質，因為它可高度溶於水，而且又極少對病毒有損，常用的層次濃度是5～20%和5～60%，商業上的sucrose常含有植物核酸酵素，(Ribonuclease)，其經高速離心後，常沈澱成類似病毒的粒子，因此使用前，最好用活性炭(Charcoal)處理後才使用，(600～700mg/ml之蔗糖溶液每100ml和5～10gm之活性炭，溫火煮沸，趁熱以有活性炭墊之濾器過濾後供用)。Glycerol(甘油)，似蔗糖之濃度及離心方法可以有相似的效果，且由此分離之材料可直接供電子顯微鏡檢查用，商品之glycerol，純度亦高，其對蛋自質之安定性亦極少有損。酒石酸鉀(Potassiumtartrate)，檸檬酸鉀(Potassiumcitrate)，也可做成好的層次比重液，不過會有將某些病毒沉澱出來的副作用。鹼性金屬之鹵化物亦常用來作此層析比重液，其黏稠度比蔗糖、甘油者之，為其壞處，但它的好處，是有的病毒在其高濃度溶液內不安定。離心材料之添加及離心：最普通的方法是將病毒溶液以小吸管小心加在層次比重液之上面即可，離心後病毒層區(Zone)之大小與病毒溶液內病毒量有關，濃縮的病毒溶液可得較好的層區。離心須在4℃之高速離心機行之，時間之長短依病毒之不同而異，例如Tobaccomosaicvirus在1X3"離心管(由3、7、7、7和4ml之0，10%，20%，30%，40%Sucrose形成之層次比重液)以SpincoModelL16之SW25.0rotor在24,000rpm約5小時即可，由離心後之層數目和層範圍的寬度(Numbersandwidthofthebands)大致可知病毒純化的程度。層次比重之製備：將不同濃度的溶液加入離心管內，形成層次比重，其添加方法有下列數種。A小漏管將之伸到離心管之管底而後將較低濃度之溶液加入，而後逐次將較高濃度溶液加入，使輕者浮上來而形成層次比重。B.小吸管將管之開口向上彎曲，管口之內徑以1～2㎜為宜，將高濃度之溶液先加而後逐次將較低濃度溶液慢慢滴在高濃度者上面而形成層次比重。A和B法製成之層次比重，宜置隔夜，使其形成均勻之層次比重後使用。2.化學劑法：此法是靠病毒特殊的化學性質來純化病毒，常用的有fluorocarbones，此可大量的將宿主細胞的脂肪和蛋白移去，而得純化的病毒。病毒像其他蛋白質一樣，亦可用有機溶劑，如甲醇(Methanol)來沈澱而得濃縮之病毒。病毒亦有用硫酸銨(AmmoniumSulfate)來沈澱而濃縮者。利用離子交換物質(Ionexchangematerials，例如Dowex所作成之173.層析法(Chromatography)Column，當病毒物質通過此Column時，用漸增鹽濃度的緩衝液，可將病毒和細胞之核蛋白分開，而得相當高純度之病毒，有很多種病毒皆可用此法作進一步之純化。4.核酸反應：此為病毒純化之最後步驟，利用核酸將病毒與核酸分開，如DNA病毒則用RNase，RNA病毒則用DNase除去污染之核酸。上述的各種病毒純化步驟均曾成功的被用過，但不同病毒往往須應用不同的方法純化之，在純化過程中在每個步驟之後，最好抽檢一下病毒之感染力(Infectivity)，與所含蛋白量，愈純化的病毒，應是含愈高感染力，而較低之蛋白含量，有時亦可以電子顯微鏡來觀察其純度。一些構造較單純的病毒，在達足夠純化時會形成結晶，許多複雜的病毒，常在純度增加時降低了其穩定度(即感染力受影響)，此可加極少量血清蛋自，以維持適當的鹽濃度而避免之。18到病毒目錄病毒的採樣1.採取時間：病材之採取時機及操作，對病毒之分離成功與否有相當重要的關係。一般而言，病材應在疾病之急性期採取，若錯過時候，則病毒之被發現機會就大會減少。2.採取：病材之採取之器具及操作應極力避免污染，組織器官之間之交叉污染亦應避免，如腸內容污染到腦等。病材採取後，置於無菌容器中，標明後立即置於冰箱中。病材在輸送過程一直到接種於適當宿主止，其間接應保持在冷的狀態下。3.輸送：病材注入無菌試管或瓶內，再置於金屬容器中(或紙板)，以紙或棉花充塞其空隙，防震及吸收滲入之液狀，此容器再置於夠大的纖維板或塑膠容器中，其間，放置足夠的乾冰，乾冰之間塞入細鉋花、木屑、碎紙等，以填充乾冰間之空隙，保護其內之容器。如果不克使用乾冰時，品質優良，中性，且以緩衝生理食鹽水泡19成之50%甘油，可資應用，但在螢光抗體檢查時，則不能使用甘油。4.儲存：病材最好保持於－70℃之下，某些病毒在－20℃～－25℃下保存時，其感染力在短時間內不致降低，但在－70℃之下，則可維持較長時間。如果使用乾冰時，則病材應置於火焰封口之安瓶內，以避免CO2影響病毒之活性，或可將病材置於螺旋蓋試管或瓶子內，再置於塑膠袋內，保存於乾冰中。到病毒目錄病毒的保存作有關病毒學方面之實驗，其病毒株保存的好壞，實關係著實驗的成效，近年來由於低溫保存技術上的進步，將病毒材料大量保存而定期作實驗仍可得一定病毒量已非難事，或是可以於不同時間取材保存而後才同時來測定病毒。對於保存之溫度及機器等之優劣點列表如下：20病毒株之保存，應將最好條件下繼代所得之材料，保存於最好之條件下，保存時應有記錄簿做詳盡之記錄，記錄事項應包括：毒株之名稱毒株之來源（分讓之研究室名．毒株從何種材料上分離，繼代於何種動物，繼代數，有關該毒株分離狀況之參考文獻等。）分讓年月日分讓之材料(如感染漿尿膜30%乳劑50%甘油食鹽水之感染小白鼠腦等。)分讓後在該實驗室繼代時之狀況，繼代者姓名，繼代數繼代採材後之保存方及保存數(Ampule數等)分讓他人時記錄其住址及年月日21毒株之繼代應在仍存有充分材料及仍有充分感染力時行之。為保存病毒材料必須了解各種病毒之特性，而選擇適當之方法與適當之安定劑(Stabilizer)，通常病毒對低溫乾燥抵抗力較強，pH7.0～7.6(弱鹼性安定，對酸性，高溫抵抗力弱，又在蛋白濃度高之液體中比較安定)。到病毒目錄病毒之定量50﹪終點計算法(50endpoint)﹪50﹪endpoint是一種病毒劑量的表示法，依據所接種之對象判定方法之不同，又可以用數種不同的表示法，如LD50(50﹪Lethaldose)即為可引起所接種之動物50﹪死亡的病毒數量，ID50(50﹪Infectiondoses)即可引起接種之動物50﹪受感染的病毒劑量，TCID50即可引起所接種之組織培養50﹪發生細胞變性之病毒劑量。1.)TCID50之計算(Reed-Muenchmethod)要測定力價之病毒作10倍階段稀釋，每個稀釋接種8面(或管)的組織細胞，每面(管)接種量0.1ml，每天觀察有無CPE或Syneytium發生(二者為病毒22發育之表徵)，連續觀察7～10天(或是觀察到病毒發育至最大限量為止)。其計算法如下表：由以上公式求得0.6加到僅高於50﹪感染率稀釋指數(此例中為10-3)得10-3.6<即為病毒作10-3.6稀釋後每0.1ml含1TCIP50，亦即該病毒之力價為10-3.6/0.1ml。2).ID50之計算ID50之計算與TCID50完全相同，但依接種動物或胚胎是否受感染而判定，感染與否之判定標準如家兔在接種豬瘟病毒之熱反應，雞胚胎接種新城雞瘟後血球凝集等。計算公式同TCID503).LD50之計算計算方法與前兩者完全相同，惟其判定標準係以接種動物或胚胎是否斃死判定之。23PlaqueMethod本法是基於一個病毒只能產生一個Plaque的原理來測定病毒之力價，亦即能應用於可在組織培養細胞產生Plaque的病毒定量。要測定的病毒作十倍稀釋後，各稀釋接種二面組織培養細胞(直徑6公分Petridish之每面接種0.4ml，容量3oz的培養瓶接種量以0.2ml為宜)，接種之細胞37℃一小時讓病毒吸著，隨後以含Agar和Neutralred之培養液重層(Agaroverlay)置室溫待Agar硬化之後，放回孵卵器，繼續3～5天後，計算Plaque數，病毒之力價即以Plaque-formingunits。Perml(PFU/ml)表示之病毒稀釋10-5.82後每ml含1PFU之病毒，亦即病毒力價為105.82PFU/ml。到病毒目錄24參考文獻：1.HessW.R.andDeTray，D.E.(1960)TheuseofleukocyteculturefordiagnosingAfricanswinefever(ASF)Bull.Epiz.Dis.afr.8,3l7.2.Malmquist,W.A.andHay，D.(1963)HemadsorptionandcytopathiceffectproducedbyAfricanswinefevervirusinswinebonemarrowandbuffycoatcultures.Amer.J.Vet.Res.24,450.3.Pan,I.C.,Hung,T.S.andHess,W.R.(1982)NewmethodofantibodydetectionbyindirectimmunoperoxidaseplaquestainingforserodiagnsisofAfricanswinefever.J,Clin.Microbil.16：650-655.4.YechieiBecker.1987.Developmentinveterinaryvirology;Africanswinefever.MartinusNijhoffPublishing,Boston.5.Wensvoort,G.,Terpstra,C.,Pol.J.M.A.,TerLaak.E.A.;Bloemrad,M.,DeKluyver,J.M.,Moonen,P.L.J.M.,Zetstra,T.,DeBoer,E.A.,Tibben,H.J.,DeJong,M.F.,Van\'tVelt,P.,Groenland,G.J.R.,VanGennep,J.A.Voets,M.T.,Verheuden,J.H.M.,andBraamskamip.J,(l991a).MysteryswinediseaseintheNetherlands:TheisolationofLelystadvirus.Vet.Q.13,121-1306.Komaniwa,H.,Fukusho,A.andShimizu,Y.1981.Micromethodforperformingtitrationandneutralizationtestofhogcholeravirususingestablishedporcinekidneystrain.Natl.Anim.Hith.Quart.,21,153-158.7.Kumagai,T.,T.Shimizu,S.Ikeda,andM.Matumoto.1961.Anewinvitromethod(END)fordetectionandmeasurementofhogcholeravirusanditsantibodybymeansofeffectofHCvirusonNewcastlediseasevirusinswinetissueculture.I.Establishmentofstandardprocedure.J.Immunol.87,245-256.8.Matumoto,M.,T.Kumagai.,T.Shimizu,andS.Ikeda.1961.Anewinvitromethod(END)fordetectionandmeasurementofhogcholeravirusanditsantibodybymeansofeffectofHCvirusonNewcastlediseasevirusinswinetissueculture.II.SomecharacteristicsofENDMethod.J.Immunol.87,257-268.9.Shimizu,T.etal,1964.Anewinvitromethod(END)fordetectionandmeasuermentofhogcholeravirusanditsantibodybymeansofeffectofHCvirusonNewcastlediseasevirusinswinetissueculture.III.ENDneutralizationtest.Arch.Ges.Virusforsch.14：215-226.10.S.S.Lai;W.C.Ho;T.S.Huang;S.K.WanandT.C,Lin.1978.AsimpleandrapidmicrotiterprocedureforENDMethodtodetermineHogCholeraantibodytiters.J.ChineseSoc.Vet.Sci.No.2：109-111.11.Afshar,A.,andG.C.Dual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