干扰素-α高分文献汇报模板ppt

汇报人：时间：PD-1阻断联合干扰素-α对肝细胞癌有协同作用ThecombinationofPD-1blockadewithinterferon-αhasasynergisticeffectonhepatocellularcarcinoma目录1.背景2.方法2.结果3.讨论背景介绍01肝细胞癌(HCC)的预后很差，总体5年生存率低于12-15%。在使用口服多激酶抑制剂或免疫检查点抑制剂(ICI)治疗晚期HCC方面取得了许多进展，但单一疗法的疗效受到频繁耐药性的限制。因此，迫切需要探索新的策略来提高治疗效果和克服耐药性。目前，程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性死亡配体1(PD-L1)是癌症治疗中最常用的ICI，其靶向PD-1/PD-L1相互作用并挽救CD8+T细胞的功能失调状态，从而有效激活抗肿瘤免疫反应。这些ICI已被证明对各种实体瘤有效。然而，它们在晚期HCC中的临床疗效并不令人满意（客观缓解率仅为20%），这主要是由于HCC微环境中CD8+T细胞缺乏浸润或功能障碍。因此，调节HCC微环境是提高对ICI反应率的潜在解决方案。干扰素-α(IFNα)已广泛应用于治疗包括HCC在内的各种恶性肿瘤。值得注意的是，IFNα可以引发强大的免疫反应以及抗肿瘤和抗血管生成作用；然而，令人惊讶的是，有大量研究集中在免疫调节的一般效果上。IFNα是免疫调节中的一把双刃剑，因为它提供必要的炎症信号，同时在肿瘤微环境中启动反馈抑制。此外，由于其系统性副作用，IFNα不再用作癌症治疗的单一疗法。尽管如此，它对免疫系统的广泛影响使IFNα有资格成为PD-1/PD-L1抑制剂的理想辅助剂，具有引发细胞毒性免疫反应的巨大潜力。最近，包括IFNα在内的细胞因子被认为是与PD-1/PD-L1阻断剂联合用于癌症治疗的潜在药物。聚乙二醇干扰素-α(Peg-IFNα)是一种半衰期较长的新剂型，由于其卓越的抗病毒功效而被广泛使用。此外，Peg-IFNα广泛应用于HCV感染，显示出其有效性和安全性。在本研究中，我们发现Peg-IFNα的给药增加了CD8+T细胞向HCC微环境的浸润，上调了CD8+T细胞中PD-1的表达，增强了PD-1抗体对HCC的治疗效果。这种组合可能是HCC的潜在免疫治疗策略。背景介绍方法02方法细胞系人HCC细胞(PLC/PRC/5)和小鼠HCC细胞系(Hepa1-6)购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所（中国上海）。体内动物研究将肝癌细胞皮下注射到小鼠体内，建立皮下植入模型。将来自皮下植入模型的肿瘤切成1mm3的立方体并植入C57BL/6/c小鼠的肝脏中。他们在植入两周后被分成4组，并接受与皮下模型相同的治疗。所有涉及动物的实验程序均经复旦大学动物护理和使用委员会（中国上海）批准。其他方法可以在在线补充方法中找到。结果03结果一——Peg-IFNα增强HCC对PD-1阻断的反应为了研究Peg-IFNα对HCCPD-1Ab反应的影响，使用Hepa1-6HCC细胞在C57BL/6小鼠中建立皮下和原位植入模型。如治疗方案如下：小鼠被分为4组，并用同种型对照、PD-1Ab、Peg-IFNα或与PD-1Ab和Peg-IFNα的组合治疗，直至研究终点（图A）。与对照组（皮下肿瘤：2.96±0.20g，P<0.001；原位肿瘤）相比，联合组（皮下肿瘤：0.40±0.11g，原位肿瘤：0.25±0.06g）对肿瘤生长的抑制作用更显着:2.10±0.10g,P<0.001),PD-1Ab组（皮下肿瘤：1.24±0.23g，P<0.01；原位肿瘤：0.82±0.19g，P<0.001）和Peg-IFNα组（皮下肿瘤：2.74±0.23g，P<0.001；原位肿瘤：1.84±0.15g，P<0.001）在皮下和原位植入模型中（图B-E）。结果二——Peg-IFNα增加HCC肿瘤微环境中的CD8+T细胞浸润为了进一步探索Peg-IFNα和PD-1Ab协同作用的潜在机制。如图A、B，然后，又比较了Hepa1-6皮下植入模型在免疫活性C57BL/6和免疫缺陷非肥胖糖尿病-严重联合免疫缺陷病(NOD/SCID)小鼠中的抗HCC作用。发现Peg-IFNα在NOD/SCID小鼠模型中显著抑制肿瘤进展，但未能减少C57BL/6小鼠中的HCC生长。此外，如图C所示，CD8+细胞毒性T细胞和自然杀伤(NK)细胞在Hepa1-6皮下肿瘤中显着增加，而非CD4+T细胞和B细胞。与上述结果一致，如图D所示，免疫荧光和免疫组织化学(IHC)染色也显示在Peg-IFNα处理后Hepa1-6肿瘤中CD8+T细胞增加。总之，这些结果表明，Peg-IFNα通过诱导竞争性CD8+T细胞的浸润，导致HCC微环境的根本重塑。结果三——Peg-IFNα处理的HCC产生趋化因子CCL4以吸引CD8+T细胞为了探索Peg-IFNα处理后免疫微环境中CD8+T细胞浸润增加的机制，如图A，进行了体外Transwell共培养试验，以评估用Peg-IFNα或对照处理的小鼠脾细胞来源的CD8+T细胞向HCC细胞系条件培养基（CM)的迁移。如图B、C所示，与对照组相比，用Peg-IFNα处理的Hepa1-6和PLC/PRF/5细胞的CD8+T细胞向CM的迁移增加。实时聚合酶链反应(qRT-PCR)显示Hepa1-6和PLC/PRC/5细胞均表达了一系列CD8+T细胞吸引趋化因子。如图D-E所示，在Peg-IFNα处理后，只有CCL4水平在两种HCC细胞系中显著上调，如图F、G，这通过CCL4特异性酶联免疫吸附测定（ELISA）验证。作为进一步确凿的证据，如图H所示，CCL4的特异性抑制剂逆转了小鼠脾细胞来源的CD8+T细胞向CM的迁移。更重要的是，如图I、J，小鼠模型和人类HCC患者的血浆CCL4水平在Peg-IFNα治疗后上调。这些发现表明，Peg-IFNα治疗可诱导HCC细胞产生更高水平的CD8+T细胞吸引趋化因子CCL4，从而导致HCC中CD8+T细胞的浸润增加。结果四——长期Peg-IFNα诱导CD8+T细胞中的PD-1表达并损害其功能由于Peg-IFNα治疗增加了HCC中CD8+T细胞浸润，进一步检测了CD8+T细胞中PD-1的表达水平，以评估其对T细胞功能的影响。如图A，发现在第6天，Hepa1-6肿瘤中PD-1+CD8+T细胞的比例没有显着变化，但在Peg-IFNα治疗后的第21天，PD-1+CD8+T细胞的比例显着增加，从9.8%增加到22.7%。如图B，这些发现通过免疫荧光分析得到验证。为了确定CD8+T细胞的功能，通过流式细胞术分析了T细胞产生IFNγ作为细胞毒性能力标记的能力。如图C，发现Peg-IFNα处理的肿瘤中IFNγ+CD8+T细胞的百分比在第6天显着增加，但在Peg-IFNα处理后第21天急剧下降。进一步从Peg-IFNα处理小鼠的脾细胞中分离出肿瘤特异性CD8+T细胞，然后进行细胞毒性测定。如图D，在Peg-IFNα处理后第21天，与第6天相比，残留的肿瘤细胞显着增加。在体外直接检测Peg-IFNα对CD8+T细胞上PD-1表达的影响，如图E，发现Peg-IFNα以剂量依赖性方式诱导CD8+T细胞上的PD-1表达。更重要的是，如图F，Peg-IFNα以剂量依赖性方式显着降低CD8+T细胞中IFNγ的产生。如图G，随着Peg-IFNα在体外对CD8+T细胞的长时间处理，T细胞的细胞毒性能力明显减弱。总而言之，这些数据表明，长期使用Peg-IFNα治疗虽然会增加HCC中CD8+T细胞的浸润，但也会通过上调CD8+T细胞上PD-1的表达来诱结果五——Peg-IFNα调控CD8+T细胞中PD-1相关信号通路为了进一步深入了解Peg-IFNα调节CD8+T细胞功能的分子机制，在使用或不使用Peg-IFNα处理的抗CD3刺激后，对小鼠脾脏CD8+T细胞的比较转录谱进行RNA测序分析。如图A所示，整个转录组的火山图显示在Peg-IFNα处理后有2122个差异表达基因。如图B，用Peg-IFNα处理的体外CD8+T细胞显示差异表达的基因主要参与免疫系统过程以及炎症和免疫反应。此外，某些基因，包括各种免疫抑制受体和凋亡分子被上调。如图C，而其他涉及Kruppel样因子(KLF)家族成员、激活标记和增殖转录因子的基因被下调。此外，如图D，基因集富集分析（GSEA）显示，与对照CD8+T细胞相比，最初在感染慢性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)的小鼠中发现的CD8+T细胞耗竭基因组在Peg-IFNα处理的CD8+T细胞中被高度激活。此外，如图E，Peg-IFNα处理的上调基因显着富集在PD-1信号转导相关的基因组中。此外，如图F，KEGG通路富集分析表明，PI3K-Akt通路和Ras信号通路在Peg-IFNα处理的CD8+T细胞中受到显著抑制。考虑到Ras和PI3K-Akt信号通路在CD8+T细胞诱导的抗肿瘤反应过程中介导PD-1信号通路，测试了Peg-IFNα处理的CD8+T中Ras和PI3K-Akt通路成分的水平细胞。如图G，蛋白质印迹结果显示，结果六——Peg-IFNα通过激活JAK1-STAT3信号通路上调CD8+T细胞中PD-1的表达为了进一步筛选出导致Peg-IFNα诱导的PD-1上调的潜在转录因子，应用了名为“Lisa”的转录因子预测系统，其中可以基于差异基因集预测潜在的转录因子。我们将测序数据与JASPAR数据库中记录的可能参与PD-1转录介导的前30个转录因子列表进行交叉匹配。如图A，重叠分析确定了持续参与PD-1转录的五个转录因子。如图B、C，STAT3是转录因子中的一个，并且进一步被证实是PD-1转录的关键转录因子。如图D，生物信息学分析确定了PD-1启动子内推定的STAT3结合位点。如图D，定点诱变表明，STAT3结合位点的突变显著降低了由Peg-IFNα调节的PD-1启动子活性。此外，如图E，使用抗STAT3抗体的ChIP测定显示，PD-1基因启动子中的推定序列被捕获。此外，如图F，使用STAT3抑制剂C188-9治疗CD8+T细胞，发现C188-9显著抑制Peg-IFNα介导的CD8+T细胞上的PD-1启动子反式激活。如图G-I，流式细胞术分析、qRT-PCR和蛋白质印迹分析还表明，C188-9显着降低了PegIFNα诱导的PD-1过表达。同样，如图J，在CD8+T细胞中通过C188-9操纵STAT3在体外逆转了抗肿瘤功能。因此，这些结果表明PegIFNα诱导STAT3表达，然后调节CD8+T细胞上结果七——PD-1抗体与Peg-IFNα的结合可以恢复和增强肿瘤抗原特异性T细胞反应为了进一步了解Peg-IFNα和PD-1抗体联合诱导的抗肿瘤免疫反应，检查了Hepa1-6肿瘤中的肿瘤抗原特异性T细胞反应。如图A，在Peg-IFNα联合PD-1抗体组中，与对照组或PD-1Ab单药组相比，浸润性CD8+T细胞数量增加。重要的是，如图B，与对照组和Peg-IFNα单药组相比，联合治疗的肿瘤中IFNγ+CD8+T细胞的百分比分别增加了1.5倍和2倍。然后，利用来自不同组的脾细胞进行了T细胞细胞毒性测定。分离的效应CD8+T细胞与自体Hepa1-6细胞共培养。如图C，与Peg-IFNα单药组相比，联合组的肿瘤细胞裂解显着增加。总而言之，这些数据支持PD-1抗体与Peg-IFNα的组合可显着恢复T细胞功能并增强其对HCC细胞的免疫反应，从而产生更大的抗肿瘤功效和生存益处。基于上述发现，如图D，提出了一个模型：Peg-IFNα可以通过诱导HCC细胞分泌CCL4来招募细胞毒性CD8+T细胞浸润HCC微环境。然而，Peg-IFNα也通过IFNα-IFNAR1-JAK1-STAT3通路上调CD8+T细胞中的PD-1表达，从而抑制它们的增殖和细胞毒能力。将PD-1抗体与Peg-IFNα联合使用可以恢复甚至增强CD8+T细胞的细胞毒能力，从而对HCC产生显著结论04结论总而言之，本研究确定Peg-IFNα不仅是一种有前途的抗肿瘤免疫反应启动剂，而且还可以产生有利于PD-1抗体的微环境。该研究可能会提出一种在HCC中联合PD-1抗体和Peg-IFNα的新策略，并为更好地联合肿瘤免疫治疗提供理论基础。讨论04讨论单药治疗无效或单独使用ICI后复发的情况仍然很常见。就HCC而言，仍有大量晚期HCC患者对ICI单一疗法无反应。对这种现象的系统研究导致对免疫刺激潜在障碍的无效治疗反应，表明ICI需要友好的状态才能发挥其最佳抗肿瘤作用。美国食品和药物管理局(FDA)批准IFNα用于治疗肾癌和黑色素瘤。我们和其他人还发现辅助IFN-α治疗可以改善根治性切除术后HCC患者的生存。本研究发现在皮下和原位HCC动物模型中，PD-1抗体和Peg-IFNα的组合显着提高了PD-1Ab单一疗法的疗效，并通过增强的T细胞浸润和激活延长了小鼠存活期。本研究证实HCC患者的肿瘤中缺乏肿瘤浸润性CD8+T细胞，有趣的是，我们发现在Peg-IFNα治疗后HCC肿瘤组织中CD8+T细胞浸润显着增加。这些数据清楚地表明，Peg-IFNα通过将微环境重塑为有利于ICI功能的友好状态，从而诱导CD8+T细胞介导的针对HCC的免疫反应。谢谢聆听THANKYOUFORLISTENING